Методы исследования Mrp4 содержащих макромолекулярных комплексов в регуляции миграции фибробластов
Summary
MRP4 регулирует различные циклические нуклеотид-зависимой сигнализации событий, включая недавно выяснены роль в миграции клеток. Мы описываем прямой, но многогранный подход к распутать вниз по течению молекулярные мишени из MRP4 что приводит к идентификации уникального MRP4 интерактома, который играет ключевую роль в отлаженной регулирования миграции фибробластов.
Abstract
Множественная лекарственная устойчивость белка 4 (MRP4) является членом АТФ-связывающего кассетного семейства мембранных транспортеров и является эндогенным Отток транспортировщик циклических нуклеотидов. Модулируя внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов, MRP4 может регулировать несколько циклических нуклеотидов-зависимых клеточных событий, включая миграцию клеток. Ранее мы показали, что при отсутствии MRP4, фибробласты содержат более высокие уровни внутриклеточного циклических нуклеотидов и могут мигрировать быстрее. Для того, чтобы понять основные механизмы этого факта, мы приняли непосредственное еще многосторонний подход. Во-первых, мы выделили потенциальные взаимодействующий белок комплексы MRP4 из MRP4 системы клеток избыточная экспрессия с использованием иммунопреципитации с последующим масс-спектрометрии. После идентификации уникальных белков в MRP4 интерактома, мы использовали изобретательности Pathway Analysis (IPA), чтобы исследовать роль этих белок-белковых взаимодействий в контексте передачи сигнала. Мы осветил роциальная роль белкового комплекса MRP4 в миграции клеток и идентифицировали F-актина как главный медиатор влияния MRP4 на миграцию клеток. В этом исследовании также была подчеркнута роль цАМФ и цГМФ в качестве ключевых игроков в миграционных явлений. Использование высокой содержанием микроскопии, мы проводили анализы клеточного миграции и наблюдали, что эффект MRP4 на миграцию фибробластов полностью отменена дезорганизацией цитоскелета или ингибирование цАМФ-зависимой киназы А (РКА). Для визуализации сигналов модуляций в мигрирующим камере в режиме реального времени, мы использовали датчик FRET на основе измерения активности РКА и обнаружили, наличие более поляризованным активности РКА вблизи передней кромки мигрирующего Mrp4 – / – фибробласты, по сравнению с Mrp4 + / + фибробласты. Это, в свою очередь, увеличилась корковой актина образование и дополненное процесс миграции. Наш подход позволяет идентифицировать белки, действующие вниз по течению к MRP4 и дает нам чрезмерновид механизма, участвующего в MRP4-зависимой регуляции миграции фибробластов.
Introduction
Миграция клеток представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Исследования показали, что во время миграции клеток поляризованы в передней и задней кромок. Присоединившись к внеклеточного матрикса, передний край обеспечивает тягу, необходимую для тела клетки, чтобы двигаться вперед. И, наконец, задняя кромка релизы в задние вложения и завершает 1,2 цикла миграции.
Ячейка поляризации для эффективной миграции клеток регулируется пространственной сегрегации внутриклеточной сигнализации. Клеточные вторичные мессенджеры, такие как цАМФ, опосредуют обособления сигнальных событий , необходимых для отлаженной направленной миграции клеток 3,4. Льготные скопления цАМФ и цАМФ-зависимой киназы РКА активности на переднем крае играют ключевую роль в направленной миграции клеток 5,6. Фосфорилированием небольшие GTPases, такие как Рас-связанной С3 ботулинического токсина субстрата (Rac) и контроль клеточного деления белка 42 гомолога или Cdc42, PKАктивирует актин-родственный белок , 2/3 (Arp 2/3) на передней кромке и вызывает образование ламеллоподиях 7-9. РКА также фосфорилирует анти укупорки агента, сосудорасширяющее стимулируется фосфопротеин (VASP), тем самым регулирует колебательные циклы расширения мембраны и втягивании 10,11.
В клетках, уровни цАМФ регулируются тремя основными процессами: я) синтезом аденилатциклазы, II) деградации под действием фосфодиэстеразы и III) перевозки по мембраносвязанных эффлюксных транспортеров 3. Множественная лекарственная устойчивость белка 4 (MRP4), член АТФ-связывающего кассетного семейства (ABC) мембранных транспортеров, функции как эндогенный эффлюксного переносчика циклических нуклеотидов. Поэтому MRP4 может регулировать уровни внутриклеточного цАМФ и цАМФ-зависимой клеточной сигнализации 11-13. Ранее мы показали , что в Mrp4 – / – фибробласты содержат относительно более высокие уровни циклических нуклеотидов и мигрируют быстрее Compared к Mrp4 + / + фибробластов 14. Мы также сообщали, двухфазный эффект циклических нуклеотидов на миграцию фибробластов. На основе предыдущих исследований , и обнаружение того, что наша Mrp4 – / – фибробласты содержат более поляризованной цАМФ в процессе миграции, мы предположили , что этот MRP4-опосредованной регулирование миграции фибробластов является цАМФ зависимой. Для того чтобы понять механизм вниз по течению, мы приняли непосредственное еще многосторонний подход.
Для того, чтобы идентифицировать белки, связанные и во взаимодействии с MRP4, мы иммуноосажденного MRP4 содержащих высокомолекулярные комплексы из клеток НЕК293, что более выражающих MRP4. Использование масс-спектрометрии, мы идентифицировали несколько MRP4-взаимодействующих белков и анализировали их взаимосвязанности с помощью изобретательности Pathway Analysis (IPA). МПА является полезным инструментом для анализа белок-белковых взаимодействий (как структурные, так и функциональные) и исследовать их вклад в частности физиологических и патологическихсобытия , основанные на литературе и экспериментальных доказательств 15,16. АПИ показали , что F-актин является основным объектом вниз по течению MRP4 в контексте миграции клеток , где цАМФ и цГМФ , являются ключевыми молекулами 17 передачи сигналов. Эти данные были подтверждены в дальнейшем высоким содержанием микроскопии. Высокое содержание-микроскопия может захватывать и анализировать поведение клеток , таких как миграция клеток в более удобной, точной и высокой пропускной способностью 18 образом. Данные высокомолекулярные содержания микроскопии показал , что влияние MRP4 на миграцию фибробластов полностью отменена после разрушения актинового цитоскелета или ингибирование ПКА 17.
Кроме того, мы использовали Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) основе датчика РКА следить за динамикой рКа в миграции клеток в реальном времени. FRET на основе датчиков киназы , как правило , состоят из специфических субстратного фосфорилирования пептидов фланкированных CFP и YFP флуорофоров 19-21. pmAKAR3 является улучшенной и меняmbrane целевой FRET основе датчика РКА , который содержит Forkhead-ассоциированный домен 1 (FHA1) и последовательность ПКА субстрат LRRATLVD 5,22. Фосфорилирование pmAKAR3 каталитическими увеличивается субъединиц рКа FRET сигнала между CFP и YFP 19. Вставка липидного домена модификации в датчике мишенях к плазматической мембране для мониторинга динамики рКа, в частности , в мембранном отсеке 23.
Используя pmAKAR3, мы показали , что передний край миграции Mrp4 – / – фибробласты экспонируются более поляризованный активность РКА чем Mrp4 + / + фибробласты, что в свою очередь увеличило корковой образование актина на передней кромке 17 ячейки. Вместе эти события привели к улучшению клеточной поляризации и миграции быстрее направленной клеток в отсутствие MRP4. Наш конкретный и прямой подход определил ключевые вниз по течению цели для MRP4 и обеспечивает важное, но, какдо сих пор неизученными механизм MRP4-зависимого регулирования миграции фибробластов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?. Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer’s disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer – an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
