Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen
Summary
Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden.
Abstract
Während die Isolierung und Kultivierung von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs) aus großen Gefäßen gut etabliert ist, haben wir versucht und Kultur VSMCs aus dem Herz-Kreislauf zu isolieren. Herzen mit intakten Aortenbogen wurden über retrograden Langendorff mit Verdauungslösung , enthaltend 300 Einheiten / ml Kollagenase Typ II, entfernt und perfundiert 0,1 mg / ml Sojabohnen – Trypsin – Inhibitor und 1 M CaCl 2. Die perfusates wurden 90 min bei 15 Minuten-Intervallen gesammelt, durch Zentrifugation pelletiert, in plating Medien resuspendiert und auf Gewebekulturschalen plattiert. VSMCs wurden durch die Anwesenheit von SM22α, α-SMA und Vimentin gekennzeichnet. Einer der Hauptvorteile dieser Technik der Verwendung ist die Fähigkeit VSMCs aus dem koronaren Kreislauf von Mäusen zu isolieren. Obwohl die geringe Anzahl von Zellen, für die die Zellen können isoliert koronaren VSMCs werden werden in einer Vielzahl von gut etablierten Zellkulturtechniken und ASSA erhalten können einige Anwendungen begrenzen verwendet, verwendetys. Studien VSMCs aus genetisch veränderten Mäuse können weitere Informationen über Struktur-Funktions-und Signalprozesse, verbunden mit vaskulären Erkrankungen bieten zu untersuchen.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist, vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) von der murine Koronarzirkulation für die Verwendung in der Zellkultur und Standard-Zellkultur-Assays zu isolieren. Wir entwickelten diese Technik, die molekularen Mechanismen des vaskulären Remodelling bei Diabetes zu beurteilen. Wir haben früher nach innen hypertrophen Umbau in den septalen koronarer Arteriolen in der db / db – Maus – Modell von Diabetes 1 berichtet. Aufgrund der begrenzten Menge an in den murinen septalen Koronararterien, experimentellen Standardtechniken gefunden Körpergeweben Protein Veränderungen (zB Western – Blot) in db / db Mäusen und Kontrollmäusen sind bestenfalls schwierig. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt , dass der Angiotensin – Rezeptor – Blocker (ARB) Losartan den Umbau in db / db – Mäusen beobachtet 2 reduziert. Daher Isolierung von primären VSMCs aus dem Herz-Kreislauf ermöglicht es uns, weitere Veränderungen im Phänotyp VSMC untersuchen oder aktivierten Signalwege in diabetischen Mäusen, die Beiträgen sein kannting widriger koronaren Arteriolen Umbau.
Zahlreiche Studien haben canonical Signalwege VSMCs isoliert aus Nagetier Aorta, anstatt in jedem spezifischen Gefäßbett unter Verwendung erläutert. Wir haben jedoch Gefäßbett spezifischen Umbau in Koronar-, Aorten gezeigt, und mesenterialen Zirkulationen von db / db – Mäusen 1, die VSMCs in jedem Gefäßbett was darauf hindeutet , kann unterschiedlich sein. Daher ist es notwendig, VSMCs von jedem Gefäßbett zu isolieren, um besser auf die pathologischen Veränderungen verstehen in jedem Satz von VSMCs auftreten. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Aorten-VSMCs. Jedoch Derzeit gibt es nur eine Studie , die auf die Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarzirkulation 3 veröffentlicht wurde. Teng et al. war der Erste, der ein Verfahren zur Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarkreislaufs Bericht zu erstatten; jedoch haben wir das Protokoll erheblich geändert, da sie auch endothelial cel isoliertls. Andere Labors habe auch das Protokoll von Teng et al. Koronaren Arterienmuskelzellen und glatten Atemwegsmuskelzellen 4,5 zu isolieren. Die Veränderungen, wir aufgenommen haben, wird eine Population von Zellen ergeben hoch für VSMCs aus dem Herz-Kreislauf angereichert.
Die retrograden Perfusion des isolierten Säugetierherzens oder Langendorff – Technik wurde 1897 von 6 Oscar Langendorff etabliert und wird noch heute weit verbreitet für die Isolierung von Herz – Kreislauf – Zellen verwendet. Die Technik, die hier präsentiert, gepaart mit dem Fortschritt der modernen murinen genetischen Veränderungen, stellt ein wertvolles Instrument zur näheren Untersuchung des molekularen Verhalten von VSMCs aus dem Herz-Kreislauf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Zweck dieser Studie war es bestehende Zellisolierung Protokolle anzupassen, die Ausbeute an koronaren glatten Gefäß von murinen Herzen zu erhöhen. Die meisten der Pionierarbeit in der Biologie der glatten Gefäßmuskulatur wurde mit kultivierten Rattenaorta glatten Muskelzellen durchgeführt. Diese Studien grundlegende Kenntnisse der molekularen Mechanismen zur Verfügung gestellt , die VSMC Wachstum steuern, Migration und Hypertrophie 7. Da jedoch das Feld fortschritt, wurde es offensichtlich, daß VS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01HL056046 auf PAL und K99HL116769 zu AJT) und das Forschungsinstitut bei Nationwide Kinderkrankenhaus (PAL und AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
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