Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu
Summary
Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.
Abstract
yalıtım ve büyük gemilerden vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) kültürü iyi bilinmektedir birlikte, koroner dolaşımdan izole Kültür VSMC'Ier çalışmıştır. Sağlam aort kemerli Kalpler çıkarılır ve sindirim çözeltisi kolajenaz tip II, 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve 1 M CaCI2 300 birim / ml içeren retrograd Langendorff ile perfüze edildi. guruplarına kaplama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline, santrifüjle topaklar haline 90 dakika boyunca 15 dakika aralıklarla toplanmış ve doku kültür tabaklarında kaplandı. VSMC'Ier SM22α varlığında α-SMA ve vimentin ile karakterize edilmiştir. Bu tekniği kullanarak ana avantajlarından biri, farelerin koroner dolaşımdan VSMC'lerde izole etmek yeteneğidir. Hücreler kullanılabilir uygulamalar için bazı sınırlar elde edilen hücrelerin küçük bir sayı, izole koroner VSMC köklü hücre kültürü teknikleri ve Assa çeşitli kullanılabilir, ancakys. genetiği değiştirilmiş farelerin VSMC'lerde araştıran çalışmalar yapı-fonksiyon ve vasküler patolojiler ile ilişkili sinyal süreçleri hakkında ayrıntılı bilgi verebilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı, hücre kültürü ve standart hücre kültürü deneylerinde kullanım için murin koroner dolaşım vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) izole etmektir. Biz Diyabette vasküler yeniden moleküler mekanizmaları değerlendirmek için bu tekniği geliştirdi. Biz daha önce diyabet 1 db / db fare modelinde septal koroner arteriyollerde hipertrofik yeniden içe bildirdi. Bağlı murin septum koroner bulunan doku miktarının sınırlı, db / db ve kontrol farelerinde protein değişiklikleri (örneğin, Western blot) araştıran standart deneysel teknikler, en iyi zordur. Buna ek olarak, daha önce anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), losartan, db / db farelerinde 2 gözlenen yenileme azalttığını göstermiştir. Bu nedenle, koroner dolaşımdan başlıca VSMC'lerde izolasyonu bize daha fazla katk olabilir diyabetik farelerde VSMC fenotip değişiklikleri veya sinyal aktive yolları, araştırmak için izin verirolumsuz koroner arteriole yeniden için ting.
Çeşitli çalışmalar değil, her belirli vasküler yatakta daha kemirgen aorta, izole VSMC kullanarak kanonik sinyal yollarını aydınlatmıştır. Bununla birlikte, farklı olabilir, her vasküler yatakta VSMC'Ierin öne vasküler yatak koroner aort belirli yenileme ve db / db farelerinde 1 mezenterik sirkülasyonu göstermiştir. Nedenle, daha iyi bir VSMC'Ierin her set meydana gelen patolojik değişiklikleri anlamak için her vasküler yatakta VSMC'Ierin izole etmek için gereklidir. izole edilmesi ve aort VSMC'Ierin kültürlenmesi için farklı yöntemler bir bolluk vardır. Ancak şu anda, fare koroner dolaşım 3'ten VSMC'Ierin izolasyonu yayımlandı sadece bir çalışma var. Teng ve ark. Fare koroner dolaşım VSMC'lerde izole etmek için bir yöntem bildirmek için ilk oldu; Ancak, önemli ölçüde protokolü değiştirdik onlar da endotel cel izole olarakls. Diğer laboratuarları da Teng ve ark gelen protokolü kullandık. Koroner arter miyositleri ve havayolu düz kas hücreleri 4,5 izole etmek. Biz dahil olan değişiklikler yüksek koroner dolaşım VSMC'Ierin zenginleştirilmiş hücrelerin bir popülasyonu verecektir.
İzole memeli kalp veya Langendorff tekniği retrograd perfüzyon Oscar Langendorff'a tarafından 1897 6 yılında kurulmuş ve hala yaygın kardiyovasküler hücrelerin izolasyonu için kullanılmaktadır bugün. Modern fare genetik modifikasyon ilerlemesi ile birleştiğinde Burada sunulan teknik, koroner dolaşımdan VSMC'Ierin moleküler davranış yakın soruşturma için değerli bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmanın amacı, fare kalplerinden pürüzsüz koroner damar verimini artırmak için mevcut hücre izolasyonu protokolleri adapte oldu. Vasküler düz kas biyoloji öncü çalışmaların çoğu kültürlenmiş sıçan aortik düz kas hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar VSMC büyüme, göç ve hipertrofisi 7 kontrol moleküler mekanizmaları temel bilgi sağladı. Alan ilerledikçe Ancak, VSMC fenotip ve işlevini vasküler yatakta özel bir dizi faktöre göre kontrol edilmişt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser (PAL ve K99HL116769 AJT için R01HL056046) Sağlık Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve Nationwide Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (PAL ve AJT kadar) oldu.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
