בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.
Abstract
בעוד הבידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מכלי גדול היא מבוססת היטב, חפשנו לבודד ותרבות VSMCs מהמחזור כלילית. לבבות עם קשתות אבי העורקים ללא פגע הוסרו perfused דרך Langendorff מדרדר עם פתרון העיכול המכיל 300 יחידות / מ"ל של סוג collagenase II, 0.1 מ"ג / מעכב טריפסין סויה מ"ל ו 1 M CaCl 2. Perfusates נאספו 15 מרווחי דקה במשך 90 דקות, pelleted ידי צנטריפוגה, resuspended בתקשורת ציפוי, מצופה על מנות בתרבית רקמה. VSMCs התאפיינו בנוכחות SM22α, α-SMA, ו vimentin. אחד היתרונות העיקריים של שימוש בטכניקה זו היא היכולת לבודד VSMCs מהמחזור כלילית של עכברים. למרות שמספר הקטנים של תאים המתקבלים יכול להגביל כמה בקשות אשר התאים יכולים להיות מנוצלים, VSMCs כלילית המבודדת ניתן להשתמש במגוון של טכניקות תרבית תא ומבוססות אסאys. מחקרים החוקרים VSMCs מעכברים מהונדסים גנטי יכולים לספק מידע נוסף אודות פונקציה-מבנה ותהליכי איתות הקשורים פתולוגיות וסקולרית.
Introduction
המטרה של שיטה זו היא לבודד תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מהמחזור כלילית murine לשימוש תרבית תאי מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. פתחנו בטכניקה זו כדי להעריך את המנגנונים המולקולריים של שיפוץ כלי דם בחולי סוכרת. דיווחנו בעבר פנימה שיפוץ היפרטרופית ב arterioles כלילית במחיצה במודל העכבר db / db של סוכרת 1. בשל הכמות של רקמה המוגבלת נמצאת התקפי הלב בעכברים במחיצה, ניסיוני בטכניקות תקן חוקר שינויי חלבון (כתם מערבי למשל) בעכברי db / db ובקרה קשות במקרה הטוב. בנוסף, אנו בעבר הראו כי וחסמי רצפטור לאנגיוטנסין (ARB) לוסרטן מפחית את שיפוץ נצפתה בעכברים db / db 2. לכן, בידוד של VSMCs העיקרי מהמחזור הכליליים מאפשר לנו לבדוק את העניין לעומק שינויים פנוטיפ VSMC או איתות מופעל מסלולים בעכברים סוכרתיים, אשר עשוי להיות contribuטינג שיפוץ עורקיק כלילי לוואי.
מחקרים רבים הובהרו מסלולי איתות הקנונית באמצעות VSMCs מבודד האאורטה מכרסם, ולא כל מיטת כלי דם ספציפית. עם זאת, יש לנו הפגינו וסקולרית-מיטה שיפוץ ספציפיים כלילית, אבי העורקים, ו תפוצה mesenteric של עכברים db / db 1, דבר המצביע על VSMCs בכל מיטה כלי הדם עשויה להיות שונה. לכן, יש צורך לבודד VSMCs מכל מיטת כלי דם כדי להיטיב להבין את השינויים הפתולוגיים המתרחשים בכל סט של VSMCs. יש שפע של שיטות שונות עבור בידוד culturing VSMCs אבי העורקים. עם זאת, כיום, יש רק מחקר אחד שפורסם על הבידוד של VSMCs מהעכבר כלילית במחזור 3. טנג et al. היה הראשון לדווח על שיטה לבידוד VSMCs ממחזור העכבר כלילית; עם זאת, יש לנו תוקנו בפרוטוקול באופן משמעותי כפי שהם גם מבודדים cel אנדותלls. מעבדות אחרות גם השתמשו בפרוטוקול מ טנג et al. לבודד מיוציטים עורקים כלילית ותאי שריר חלק בדרכי הנשימה 4,5. השינויים שאנו נשלב יניבו אוכלוסיית התאים מועשרים עבור VSMCs מהמחזור כלילית.
זלוף המדרדר של לב היונק המבודד, או טכניקת Langendorff, הוקם בשנת 1897 על ידי 6 אוסקר Langendorff ועדיין משמש היום נרחב עבור הבידוד של תאים וכלי דם. הטכניקה המוצגת כאן, יחד עם התקדמות שינויים גנטיים בעכברים מודרניים, מספקת כלי רב ערך לחקירה מדוקדקת יותר של ההתנהגות המולקולרית של VSMCs מהמחזור כלילית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה להסתגל פרוטוקולי בידוד תא קיימים כדי להגדיל את התשואה של כלילית כלי דם החלקה מלבבות בעכברים. רוב העבודה החלוצית בביולוגיה השריר החלק בכלי הדם בוצע עם תאי שריר חלק אבי העורקים חולדה תרבותי. מחקרים אלה סיפקו את הידע הבסיסי של המנגנונים המולקולר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01HL056046 ל PAL ו K99HL116769 כדי AJT), ואת המכון לחקר ב- Nationwide בית החולים לילדים (ל PAL ו AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
