In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila
Summary
Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.
Abstract
Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.
Introduction
Caspasen zijn cysteïne proteasen die apoptotische celdood bemiddelen door het splitsen van een groot aantal intracellulaire eiwitten na sleutel aspartaat residuen. Bijvoorbeeld, initiator caspases te activeren effector caspasen, derepresseren DNA nucleasen, splitsen cytoskelet componenten en de lipide samenstelling van celmembranen veranderen om snel te ontmantelen cellen en hun erkenning en engulfment stimuleren door naburige cellen die beschikken over de cel lijken. 1-4 Er wordt geschat dat miljarden cellen sterven per dag in het menselijk lichaam, en apoptose is een belangrijk mechanisme van door chemotherapie geïnduceerde tumorceldood. 5 een andere groep caspasen kan celdood dan veroorzaken bij verschillende niet-apoptotische processen aangeboren immuniteit stimuleren. 6, het meeste onderzoek op caspases is gericht op hun pro-dood functies.
Interessant vroeg bewijs op het gebied bleek dat dezelfde caspasen verantwoordelijk voor het bevorderen celdood ook niet dood fzalven. Baanbrekende studies hebben aangetoond dat caspasen zijn betrokken bij diverse cellulaire functies in gezonde cellen, waaronder de regulering van celproliferatie en celmigratie tijdens embryogenese. 7-9 Caspasen zijn vereist voor spermatide individualisering in Drosophila 10,11, voor het blokkeren van een alternatieve necroptotic celdood in muizen 12,13, en microRNA verwerking in C. elegans. 14,15 In misschien de langste duur cellen, neuronen, caspasen en andere apoptotische mechanisme betrokken zijn bij de regulering van de neuronale activiteit van snoeien synaptische uiteinden, een proces vermoedelijk essentieel zijn andere synapsen voor leren en geheugen versterken. 16- 18 Het is mogelijk dat caspases pruning een soort mini-apoptose kleine neuronale uitsteeksels niet met hele celdood bevorderen. 19 echter caspasen kunnen alternatieve functies verbonden moeten apoptose-achtige verschijnselen. 20,21 dubbelrols in het leven en de dood zijn niet uniek voor caspases; BCL-2 familie eiwitten en cytochroom c zijn rol in cellulaire energetica in gezonde cellen, maar maken ook deel uit van de kern apoptotische route die geactiveerd wordt door veel celtypen stress. 22-25 Hoewel niet bewezen, lijkt het logisch dat de evolutie dag is gekoppeld -Jobs dood-banen binnen dezelfde moleculen om tijdig eliminatie van ongeschikte of ongewenste cellen te waarborgen.
Op dit moment worden de moleculaire mechanismen van apoptotische caspase activiteit begrepen, en de mate van niet-apoptotische caspase activiteit tijdens embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels is ook niet bekend. Een belangrijke uitdaging is de moeilijkheid in het onderscheiden van dag-banen van de dood-banen van caspases. In tegenstelling tot apoptose en pyroptosis wanneer caspase-activiteit wordt versterkt door een proteolytische cascade worden de dag-banen van caspases verwacht bij veel lagere niveaus van enzymatische activiteit, vermoedelijk beneden detectie plaatsvinden door vele beschikbare technologies.
Voor de hier gepresenteerde werk, anderen ontwikkeld diverse caspase biosensoren voor verschillende doeleinden. De SCAT biosensoren (bijv ECFP-DEVD-Venus) snel op te sporen real-time caspase-activiteit in gekweekte cellen en dierlijke weefsels met behulp van FRET. 26,27 Bij caspase decollete, de kern gerichte GFP deel van Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) ondergaat subcellulaire herlokalisatie binnen enkele minuten wanneer de plasmamembraan-tether wordt gesplitst door caspases. 28 Evenzo NES-DEVD-YFP-NLS ApoAlert-pCaspase3-Sensor () herlokaliseert van het cytoplasma naar de kern op caspase decollete. 29,30 Meer voor kort werd de chromofoor in iCasper slim ontworpen om fluoresceren wanneer gesplitst door caspases, waardoor de detectie van biosensor in real-time in neuronen van Drosophila embryo's, maar vooral in combinatie met een ontwikkelingsstoornis celdood. 31 caspase-afhankelijke dood van olfactorische neuronen tijdens veroudering was demonstbeoordeeld door immunodetectie van de caspase-gesplitste vorm van CPV biosensoren (bijvoorbeeld mCD8 PARP-Venus). 32,33 Belangrijk is dat de geactiveerde vorm van caspase-3 in afwezigheid van celdood gedetecteerd door gevoelige immunostain in stekels van gekweekte neuronen, en in het soma via caspase-afhankelijke fluorescentie van het nucleaire CellEvent reporterkleurstof, maar probleemgevallen door foto-toxiciteit, hoewel celdood werd uitgesteld tot na wervelkolom eliminatie. 19 Aldus nieuwe caspase biosensoren nodig detecteren en volgen basale cellen met caspase-activiteit in vivo.
Om deze moeilijkheden te overwinnen, genereerden wij een nieuwe tweekleurige caspase biosensor, aangewezen CaspaseTracker. Deze strategie combineert een aangepaste versie van de Drosophila caspase-gevoelige Apoliner biosensor 28 met de Drosophila G-TRACE FRT recombinasesysteem 34 permanent labelen en volgen cellen in vivo. <sup> 35 Het Gal4-geactiveerde G-trace systeem maakt het mogelijk zeer lage niveaus van caspases tot CaspaseTracker activeren, wat resulteert in RFP expressie in het cytoplasma en permanente GFP expressie nucleair doelwit in een cel die ooit caspase activiteit heeft meegemaakt. 35 Dit systeem kan labelen cellen in leven in gehele dieren met behulp van Drosophila melanogaster, een soepel en veel gebruikt model voor de studie van caspases en celdood. 36-38
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier illustreren we de bouw en de innerlijke werking van CaspaseTracker dat de detectie van een brede basale caspase-activiteit in gezonde weefsels te vergemakkelijken. De kritische stappen voor het detecteren van niet-apoptotische caspase activiteit in vivo zijn: 1) het genereren van vliegen met de biosensor transgen 2) na caspase-reporter functie met geschikte controles, 3) de toepassing dissectie technieken om alle interne orgaansystemen van de volwassen Drosophila observeren, en 4) onderscheiden bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Polan Santos en Darren Obbard voor Drosophila illustraties in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena voor het gebruik van de JHMRI insectary. Dit werk werd ondersteund door het Life Science Research Foundation fellowship (HLT), University Grants Committee van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), en NIH subsidies NS096677, NS037402 en NS083373 (JMH). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.
Materials
| CONSUMABLES AND REAGENTS | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W | AmScope | WBM99316 | Light source |
References
- Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation – stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
- Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
- Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
- Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
- Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
- Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
- Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
- Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
- Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
- Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
- Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
- Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
- Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
- Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
- Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
- Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
- To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
- Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
- Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
- Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
- Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
- Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
- Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
- Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
- Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
- Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
- Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
- Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
- Green, D. R. . Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , (2011).
- Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
- Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
- Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
- Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).
