In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks
Summary
Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.
Abstract
Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.
Introduction
Kaspazlar önemli aspartat kalıntısı sonra uzun hücre içi proteinleri bölünmesiyle apoptotik hücre ölümüne aracılık sistein proteazlardır. Örneğin, başlatıcı kaspaz efektör Kaspaz, baskılanmasını durdurmak DNA nükleazlar, bölen iskelet parçaları etkinleştirmek ve hücreleri hızla demontaj ve hücre cesetlerin imha komşu hücreler tarafından kendi tanıma ve yutulmasına uyarmak için hücre zarlarının lipit kompozisyonunu değiştirmek. 1-4 tahmin edilmektedir hücrelerin milyarlarca insan vücudunda günde ölür, ve apoptoz kemoterapi kaynaklı tümör hücre ölümünün önemli bir mekanizması olduğunu. 5 caspases farklı bir dizi doğal bağışıklığı uyarmak için farklı olmayan apoptotik süreçler tarafından hücre ölümüne neden olabilir. 6 bu nedenle, kaspaslara çoğu araştırma yanlısı ölüm fonksiyonları üzerine yoğunlaşmıştır.
İlginç bir şekilde, alanda dair kanıtlar teşvik hücre ölümünden sorumlu olan kaspaz non ölüm f olduğunu ortayaonksiyonlar ı. Öncü çalışmalar kaspazlar embriyojenez esnasında hücre çoğalması ve göçünün düzenlenmesinde dahil olmak üzere sağlıklı hücrelerde çeşitli hücresel fonksiyonları yer aldığını göstermiştir. 7-9 Kaspazlar alternatif necroptotic hücre ölüm yolunu bloke etmek için, Drosophila 10,11 spermatid Kişiselleştirme için gereklidir farelerde 12,13 ve mikroRNA işleme C. elegans. 14,15 belki de en uzun ömürlü hücreler, nöronlar, kaspaz ve diğer apoptotik makine sinaptik sonlar budama yoluyla nöronal aktivitenin düzenlenmesinde rol olan, inanılan bir süreç öğrenme ve hafıza için diğer sinaps güçlendirmek için önemli olduğu. 16- 18 kaspazlar bütün hücre ölümü olmadan minik nöronal projeksiyonları mini apoptoz bir türüne göre sinaptik budama kolaylaştırmak mümkündür. 19 Bununla birlikte, kaspaz apoptoz gibi olaylara ilgisiz alternatif işlevlere sahip olabilir. 20,21 Çift rolüyaşam ve ölüm s caspases özgü değildir; Kanıtlanmış olmasa da BCL-2 ailesi proteinleri ve sitokrom-c sağlıklı hücrelerde hücresel enerji endüstrisinde rol var ama aynı zamanda hücre stres birçok türleri tarafından aktive edilir çekirdek apoptotik yolun bir parçasıdır. 22-25, evrim gün bağlantılı olduğu mantıklı görünüyor uygun olmayan veya istenmeyen hücrelerin zamanında eleme sağlamak için aynı moleküllerden içinde ölüm işlere -iş.
Şu anda, apoptotik olmayan kaspaz etkinliğinin moleküler mekanizmalar anlaşılmamıştır ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi bulunması da bilinmemektedir. Büyük bir meydan okuma caspases ölüm işlerden gün işleri ayırmada zorluk olduğunu. kaspaz aktivitesi bir proteolitik akışı ile amplifiye edilir apoptoz ve pyroptosis, aksine, kaspaz günlük iş mevcut olan birçok techn göre büyük olasılıkla algılanan değer altına enzimatik aktivite çok daha düşük seviyelerde olması beklenmektedirologies.
Burada sunulan çalışma öncesinde, diğerleri farklı amaçlar için kaspaz biyosensörler çeşitli geliştirdi. SCAT biyosensörler (örneğin, ECFP-DEVD-Venüs) hızla FRET kullanarak kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında gerçek zamanlı kaspaz aktivitesini algılar. 26,27 kaspaz bölünme üzerine, Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nükleer hedefli GFP kısmı nucGFP) plazma membran bağlama caspase'lar tarafından yarılır dakika içinde hücre içi yerini değiştirmesi geçirmektedir. 28 Benzer şekilde, ApoAlert-pCaspase3 Sensör (NES-DEVD-YFP NLS) kaspaz yarılma üzerine çekirdeğe sitosolden relocalizes. 29,30 fazlası son zamanlarda, iCasper içinde kromofor akıllıca Drosophila embriyo nöronların gerçek zamanlı olarak biyosensör etkinliğinin bulgulanması izin kaspaz parçalanabilen, ancak öncelikle gelişimsel hücre ölümü ile ilişkili olarak kaldığında parlayan şekilde işleme sokuldu. koku nöronların 31 Kaspaz bağımlı ölüm olduğu yaşlanma sırasında demonstGBM biyosensörler (örneğin, bunun ardından mCD8-PARP Venüs) kaspaz-klivaj formunun immüno-algılama derecelendiren. 32,33 Önemli olarak, kaspaz-3 aktive edilmiş şekli dikenler duyarlı immunostain hücre ölümünün kaybolması saptandı kültürlü nöronlar ve soma nükleer CellEvent raportör boyanın kaspaz-bağımlı floresan kullanılarak, ancak hücre ölümü omurga eleme sonrasına kadar ertelendi olmasına rağmen zorluklar nedeniyle foto-toksisite rastlanmıştır içinde. 19 Böylece, yeni kaspaz biyosensörler algılamak için gerekli olan ve in vivo bazal kaspaz aktivitesi ile hücreleri izlemek.
Bu zorlukları aşmak için, biz CaspaseTracker belirlenen yeni çift renkli kaspaz biyosensör, oluşturulan. Bu strateji kalıcı etiket ve in vivo hücreleri izlemek için Drosophila G-İZ FRT rekombinaz sistemi 34 ile Drosophila kaspaz-duyarlı Apoliner biyosensör 28 değiştirilmiş bir sürümü birleştirir. <sup> 35 Gal4 aktive G-TRACE sistemi. caspases çok düşük seviyelerde hiç kaspaz aktivitesini yaşadı herhangi bir hücrede sitoplazma ve kalıcı bir nükleer hedefli GFP ifade RFP ifade sonuçlanan CaspaseTracker etkinleştirmek için izin verir 35 Bu sistem etiketleyebilirsiniz Drosophila melanogaster, kaspaz ve hücre ölümü çalışma için izlenebilir ve yaygın olarak kullanılan bir model sistemi kullanarak tüm hayvanlarda ömrü boyunca hücreleri. 36-38
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sağlıklı dokularda yaygın bazal kaspaz aktivitesinin saptanmasını kolaylaştırmak CaspaseTracker inşaat ve iç işleyişini göstermektedir. In vivo olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit etmek için kritik adımlar şunlardır: 1) 2) uygun kontroller ile kaspaz-özel raportör fonksiyonu doğrulayarak, 3) diseksiyon tekniklerini uygulayarak yetişkin Drosophila tüm iç organ sistemlerini gözlemlemek, biyosensör transgen ile sinekleri üreten, autofluorescent eserler gelen ve 4)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Şekil Drosophila çizimler için Polan Santos ve Darren Obbard teşekkür ederiz. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena JHMRI insectary kullanımı için. Bu çalışma Hayat Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenmiştir, Üniversite Ödenekler Komitesi Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) ve NIH NS096677, NS037402 ve NS083373 (JMH) verir. Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.
Materials
| CONSUMABLES AND REAGENTS | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W | AmScope | WBM99316 | Light source |
References
- Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation – stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
- Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
- Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
- Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
- Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
- Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
- Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
- Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
- Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
- Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
- Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
- Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
- Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
- Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
- Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
- Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
- To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
- Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
- Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
- Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
- Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
- Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
- Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
- Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
- Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
- Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
- Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
- Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
- Green, D. R. . Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , (2011).
- Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
- Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
- Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
- Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).
