インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します
Summary
カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。
Abstract
Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.
Introduction
カスパーゼは、キーアスパラギン残基の後に多くの細胞内のタンパク質を切断することにより、アポトーシス細胞死を仲介するシステインプロテアーゼです。例えば、イニシエーターカスパーゼは、エフェクターカスパーゼ、活性化するDNAヌクレアーゼ、切断する細胞骨格成分を活性化し、急速に細胞を分解し、細胞の死骸の処分隣接細胞によってそれらの認識と貪食を刺激するために、細胞膜の脂質組成を変化させる。1-4それが推定されます細胞数十億は、ヒトの体内で一日あたり死亡し、アポトーシスが化学療法誘発性腫瘍細胞死の重要なメカニズムである。5カスパーゼの異なるセットは、先天性免疫を刺激する別個の非アポトーシス過程による細胞死を引き起こす可能性があります。6ので、カスパーゼ上のほとんどの研究は、それらのプロ死の機能に焦点を当てています。
興味深いことに、フィールドの初期の証拠は、細胞死を促進する責任同じカスパーゼは、非死Fを有していることを明らかにしましたunctions。先駆的な研究では、カスパーゼは、胚形成の間の細胞の増殖および遊走の調節を含む正常細胞における多様な細胞機能に関与していることが示されている。7-9カスパーゼが代替ネクロトーシス細胞死経路を遮断するため、 ショウジョウバエ 10,11に精子細胞を個別に必要とされますマウス12,13で、およびマイクロRNAの処理のためにCでエレガンス 。おそらく最長寿命の細胞、ニューロン、カスパーゼおよび他のアポトーシス機構は、シナプス終末を剪定することによって神経活動の調節に学習や記憶のための他のシナプスを強化することが不可欠であると考えられてプロセスを関与している。16で14,15 18カスパーゼは、全細胞死なしで小さな神経突起のミニアポトーシスのタイプによってシナプス刈り込みを容易にすることが可能である。19しかし、カスパーゼはアポトーシスのようなイベントとは無関係の代替機能を有していてもよい。20,21二重の役割生と死でsがカスパーゼに固有のものではありません。 BCL-2ファミリータンパク質とシトクロムcは、健康な細胞における細胞エネルギー論における役割を持っているだけでなく、細胞ストレスの多くの種類によって活性化されるコアアポトーシス経路の一部である。22-25証明されていないが、進化は日がリンクされていることを論理的なようです不適当または望ましくない細胞のタイムリーな除去を確実にするために、同じ分子内の死ジョブに-jobs。
現在のところ、非アポトーシスカスパーゼ活性の分子メカニズムは理解されていない、および胚発生中および成体組織における非アポトーシスカスパーゼ活性の程度もまた知られていません。大きな課題は、カスパーゼの死の仕事から一日の仕事を区別するのが困難なことです。カスパーゼ活性は、タンパク質分解カスケードによって増幅された場合、アポトーシスおよびpyroptosisとは対照的に、カスパーゼの日の仕事は、多くの利用可能なTECHNによる検出以下おそらく、酵素活性の非常に低いレベルで発生することが予想されますologies。
ここで提示作業の前に、他のものは、異なる目的のためにカスパーゼバイオセンサの様々な開発しました。 SCATバイオセンサー（ 例えば 、ECFP-DEVD-金星）急速にFRETを用いて培養細胞や動物組織におけるリアルタイムのカスパーゼ活性を検出する。26,27カスパーゼ切断されると、Apolinerの核標的GFP部分（mCD8-RFP-DQVD- nucGFP）その形質膜テザーは、カスパーゼによって切断されるときに数分以内に細胞内再局在を受ける。28同様に、ApoAlert-pCaspase3センサー（NES-DEVD-YFP-NLS）は、カスパーゼ切断の際に核に細胞質ゾルからrelocalizes。29,30詳細最近、iCasperにおける発色団は、巧みショウジョウバエ胚のニューロンでリアルタイムにバイオセンサ活性の検出を可能にする、カスパーゼによって開裂が、主に発達、細胞死に関連したときに蛍光を発するように操作した。嗅覚ニューロンの31カスパーゼ依存性死たエージング中demonstCPVバイオセンサー（ 例えば、mCD8-PARP-金星）のカスパーゼ切断形の免疫検出することによって評価した。32,33重要なのは、カスパーゼ3の活性化形態は、棘に敏感な免疫染色による細胞死の非存在下で検出されましたこのように、新たなカスパーゼバイオセンサーを検出するために、培養神経細胞、および細胞体に核CellEventレポーター色素のカスパーゼ依存性蛍光を用いたが、細胞死は背骨除去後まで延期されたものの難しさが、原因フォト毒性に遭遇した。19を必要としていますおよびin vivoでの基礎カスパーゼ活性を有する細胞を追跡。
これらの困難を克服するために、我々はCaspaseTracker指定された新規のデュアルカラーカスパーゼバイオセンサーを、生成されました。この戦略は、恒久的に、in vivoで細胞を標識し、追跡するために、 ショウジョウバエ G-TRACE FRTリコンビナーゼ系34とショウジョウバエカスパーゼ敏感Apolinerバイオセンサー28の修正版を兼ね備えています。<> 35 SUP GAL4活性化G-TRACEシステムは、カスパーゼの非常に低いレベルが今までカスパーゼ活性を経験している任意の細胞で細胞質と恒久的な核標的GFP発現にRFPの発現をもたらす、CaspaseTrackerを活性化することができます。35このシステムはラベルを付けることができキイロショウジョウバエ 、カスパーゼおよび細胞死の研究のための扱いやすいと広く使用されているモデル系を用いて、動物全体での生活を通して細胞。36-38
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、建設、健康な組織で広く基礎カスパーゼ活性の検出を容易CaspaseTrackerの内部動作を説明します。 生体内で非アポトーシスカスパーゼ活性を検出するための重要なステップは次のとおりです：1）2）適切なコントロールとカスパーゼ特異的レポーターの機能を検証すること、3）解剖の技術を練習する大人のショウジョウバエのすべての内部器官系を観察するために、バ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は図中のショウジョウバエのイラストのためポランサントスとダレンObbardに感謝します。図2a、マルセロ・ジェイコブス – ロレーナJHMRIの昆虫館の使用のために。この作品は、香港のAoE / B-07/99の大学補助金委員会（MCF）、ライフサイエンス研究財団のフェローシップ（HLT）によって支持され、NIHはNS096677、NS037402とNS083373（JMH）を付与しました。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローです。
Materials
| CONSUMABLES AND REAGENTS | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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