In vivo Biosensor Tracks Non-apoptotiske caspase aktivitet i Drosophila

Summary

For å detektere friske celler i hele dyr som inneholder lave nivåer av kaspase-aktivitet, ble den meget følsomme biosensor betegnet CaspaseTracker generert for Drosophila. Caspase-avhengig biosensor-aktivitet er detektert i langlivede friske celler gjennom de indre organer hos voksne dyr oppdrettet i henhold optimaliserte betingelser i fravær av døds stimuli.

Abstract

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Introduction

Caspases er cystein proteaser som medierer apoptotisk celledød ved å spalte mange intracellulære proteiner etter nøkkel aspartat rester. For eksempel, initiativtaker caspases aktivere effektor caspases, derepress DNA nukleaser, hold fast cytoskeletal komponenter og endre lipid sammensetningen av cellemembraner for å raskt demontere celler og stimulere deres anerkjennelse og engulfment av naboceller som avhende celle lik. ^1-4 Det er anslått at milliarder av celler dør per dag i menneskekroppen, og apoptose er en viktig mekanisme av kjemoterapi-indusert tumor celledød. ⁵ et annet sett av caspaser kan føre til celledød ved distinkte ikke-apoptotiske prosesser for å stimulere medfødt immunitet. ⁶ Derfor det meste av forskningen på caspases har fokusert på sine pro-døden funksjoner.

Interessant, tidlig bevis i feltet viste at de samme caspases ansvarlig for å fremme celledød har også ikke-døden functions. Banebrytende studier har vist at caspaser er involvert i forskjellige cellulære funksjoner i friske celler, inkludert regulering av celleproliferasjon og migrering under embryogenese. ^7-9 Kaspaser er nødvendig for individualisering spermatid i Drosophila ^10,11, for blokkering av en alternativ reaksjonsvei necroptotic celledød i mus ^12,13, og for mikroRNA behandling i C. elegans. ^14,15 i kanskje den lengste levetid celler, nerveceller, caspases og andre apoptotisk maskiner er involvert i reguleringen av neuronal aktivitet ved beskjæring synaptiske avslutninger, en prosess antas å være avgjørende for å styrke andre synapser for læring og hukommelse. ^{16- 18} Det er mulig at caspases lette synaptiske beskjæring av en type mini-apoptose av ørsmå nevrale projeksjoner uten hele celledød. ¹⁹ Men caspases kan ha alternative funksjoner som ikke er relatert til apoptose-lignende hendelser. ^20,21 Dual rolles i liv og død er ikke unikt for caspases; BCL-2 familie proteiner og cytokrom c har roller i mobilnettet energetikk i friske celler, men er også en del av kjernen apoptotiske sti som aktiveres av mange typer stress i cellene. ^22-25 Selv om det ikke bevist, virker det logisk at evolusjon har koblet dag -jobs til døds jobber innenfor de samme molekylene å sikre rettidig eliminering av uegnede eller uønskede celler.

I dag er de molekylære mekanismene for ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet ikke er forstått, og graden av ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet under embryonal utvikling og i voksent vev er heller ikke kjent. En stor utfordring er vanskeligheten med å skille dagsjobber fra døds jobber av kaspaser. I motsetning til apoptose og pyroptosis, når caspase aktivitet forsterkes av et proteolytisk kaskade, er de dag jobber av caspases forventes å skje på mye lavere nivå av enzymatisk aktivitet, trolig under påvisning av mange tilgjengelige technologies.

Før arbeidet som presenteres her, andre utviklet en rekke caspase biosensorer for ulike formål. SCAT biosensorer (f.eks ECFP-DEVD-Venus) raskt oppdage sanntid caspase aktivitet i dyrkede celler og animalsk vev ved hjelp av gnage. ^26,27 Ved caspase cleavage, den atom målrettet GFP-delen av Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) gjennomgår subcellulære relocalization i løpet av minutter når sin plasmamembran-tjore spaltes av kaspaser. ²⁸ Tilsvarende ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes fra cytosol til kjernen på caspase cleavage. ^29,30 Mer nylig, kromoforen i iCasper ble ekspedert konstruert til å fluorescere når spaltet av kaspaser, som tillater deteksjon av biosensor aktivitet i sanntid i neuroner i Drosophila embryo, men først og fremst i forbindelse med utviklings celledød. ³¹ Caspase-avhengig død av olfactory neuroner i løpet av aldring var demonstrerer atvurdert ved immun-påvisning av caspase-spaltet form av CPV biosensorer (f.eks mCD8-PARP-Venus). ^32,33 Viktigere, ble den aktiverte formen av caspase-3 detekteres i fravær av celledød ved sensitive immunfarging i ryggrader av dyrkede nerveceller, og i soma med caspase-avhengig fluorescens av atom CellEvent reporter fargestoff, men noe var vanskelig på grunn av foto-toksisitet, selv om celledød ble utsatt til etter ryggraden eliminering. ¹⁹ Dermed nye caspase biosensorer for å oppdage og spor celler med basal kaspase-aktivitet in vivo.

For å overvinne disse vanskelighetene, genererte vi en ny tofarget caspase biosensor, betegnet CaspaseTracker. Denne strategien kombinerer en modifisert versjon av Drosophila caspase-sensitive Apoliner biosensor ²⁸ med Drosophila G-TRACE FRT rekombinase system ³⁴ for permanent å merke og spore-celler in vivo. <sup> 35 GAL4-aktivert G-TRACE system tillater meget lave nivåer av caspaser å aktivere CaspaseTracker, noe som resulterer i RFP ekspresjon i cytoplasma og faste kjerne målrettet GFP-ekspresjon i en hvilken som helst celle som noensinne har opplevd kaspase-aktivitet. ³⁵ Dette systemet kan merke celler i hele livet i hele dyr ved hjelp av Drosophila melanogaster, en medgjørlig og mye brukt modellsystem for studier av kaspaser og celledød. ^36-38

Protocol

1. Utarbeidelse av CaspaseTracker Fluer For å forberede CaspaseTracker (DQVD) flyr for eksperimenter, utfører dette korset: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi> Stopp> GFP-NLS), ved å overføre 7-10 jomfru kvinne (eller mann) fluer bærer caspase biosensor underlaget mCD8-DIAP1-Gal4 drevet av ubiquitin promoter 35 sammen med like mange menn (eller kvinne) G-TRACE fluer, som har andre kromosomet cYO balancer for å unngå dødelighet av homozygot kombinasjo…

Representative Results

Det er to viktige komponenter som gjør at CaspaseTracker å oppdage caspase aktivitet i normale friske celler (Figur 1a). Den første av disse er et 146 aminosyre caspase-spaltbare polypeptid modellert etter caspase biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Dette polypeptid er avledet fra DIAP1 (Drosophila inhibitor av apoptose) inneholdende et enkelt naturlig forekommende kaspase område som blir spaltet i løpet av apoptose typisk av caspa…

Discussion

Her viser vi bygg- og driften av CaspaseTracker som letter påvisningen av utbredt basal caspase aktivitet i friskt vev. De kritiske trinn for å detektere ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet in vivo, er: 1) generering av fluer med biosensoren transgenet, 2) verifisering av caspase-spesifikk rapportørfunksjon med hensiktsmessige kontroller, 3) å praktisere disseksjon teknikker for å observere alle interne systemer av voksen Drosophila organ, og 4) skille biosensor aktivitet fra autofluorescent gjenst…

Materials

CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield	Vector Products	H-1000	Mounting medium
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Antibody Registry ID:  AB_528218	Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961	to preserve fluorophores
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	Product code: 0001023934	for dissection plates
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W	AmScope	WBM99316	Light source