Generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico Comportamiento
Summary
This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.
Abstract
Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.
Introduction
El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer 1. alta tasa de mortalidad de cáncer de mama se debe principalmente a la falta de la terapia convencional para mitigar y eliminar la enfermedad metastásica; aproximadamente el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer se deben a la metástasis 2. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de la cascada metastásica es de suma importancia para el desarrollo de terapias eficaces tanto en temprano y el cáncer de seno en etapa tardía.
Las investigaciones anteriores han ayudado a aclarar la naturaleza de múltiples etapas de la metástasis del cáncer de mama y se plantea la hipótesis de que el resultado de la progresión de cáncer y la metástasis depende en gran medida de las interacciones entre las células cancerosas y el entorno de acogida 3. Las observaciones clínicas indican que muchos tipos de cáncer presentan tropismo de órganos, es decir., La tendencia a la metástasis preferentemente a lo específico organs.In el case de cáncer de mama, la enfermedad de un paciente típicamente se extiende o metástasis a 5 sitios principales, incluyendo el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado y el cerebro 4-6. Muchas teorías se han desarrollado para explicar este proceso, pero sólo unos pocos han resistido la prueba del tiempo. La teoría de Ewing de metástasis, se propone en la década de 1920, la hipótesis de thatthe distribución de la metástasis era estrictamente debido a factores mecánicos; por el que las células tumorales se llevan a través del cuerpo por los patrones de flujo de la sangre fisiológica definidos normales y simplemente detienen en el primer lecho capilar que encuentran 7. Por el contrario, "semilla y del suelo" hipótesis de Stephen Paget 1889 sugirió que las interacciones moleculares adicionales fueron responsables de la supervivencia y el crecimiento de metástasis, en el que las células cancerosas ( "semillas") sólo pueden establecerse y microambientes de órganos proliferatein que producen factores moleculares apropiados ( "suelo ") 8. Casi un siglo más tarde, Leonard Weiss bajotomó un meta-análisis de los datos publicados anteriormente de la autopsia y se confirmó la predicción de Ewing que muchos tumores metastásicos detectados en el momento de la autopsia se encontraron en las proporciones previstas que se esperarían si metastásico tropismo órgano fue determinado por patrones de flujo sanguíneo solo. Sin embargo, en manyinstances hubo menos o más metástasis formadas en ciertos sitios a continuación, se podría esperar por factores mecánicos propuestos 9 de Ewing. Estas cuentas y teorías sugieren que los microambientes de órganos específicos desempeñan un papel fundamental en los patrones de difusión y posterior crecimiento y la supervivencia de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama.
Últimos esfuerzos de investigación se han centrado principalmente en los factores derivados de células del tumor y su contribución al tropismo de órganos observado en la metástasis del cáncer de mama 10-12, factores sin embargo pocos estudios han explorado derivados del microambiente de órganos que pueden proporcionar un nicho favorable para el establecimientode metástasis de cáncer de mama. Esto se debe en gran parte a las dificultades técnicas de estudio de los componentes del microambiente de órganos in vitro.
El presente artículo describe un sistema ex vivo integral modelo para el estudio de la influencia de los componentes solubles de los ganglios linfáticos, hueso, pulmón, cerebro y en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama humano. Estudios anteriores han validado este modelo de sistema mediante la demostración de que las diferentes líneas celulares de cáncer de mama muestran un comportamiento maligno de células línea específica y órgano-específica en respuesta a los medios de comunicación de órganos acondicionado que corresponde a su in vivo potencial metastásico 13. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y evaluar los factores solubles de órganos derivados específicos que pueden desempeñar un papel en el comportamiento metastásico de mama y otros tipos de células cancerosas, incluyendo las influencias sobre el crecimiento, la migración, el comportamiento y la expresión de genes como tallo, así como la identificación deposibles nuevas dianas terapéuticas para el cáncer. Este es el primer sistema de modelo ex vivo que se puede utilizar para estudiar el comportamiento metastásico de órganos específicos en detalle y para evaluar el papel de los factores solubles derivados de órganos en la conducción del proceso de la metástasis del cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metástasis es un proceso complejo por el cual una serie de eventos celulares que son en última instancia responsable de la invasión de tejidos y tumores distantes establecimiento 4,30,31. El sistema modelo ex vivo que aquí se presenta puede ser utilizado para estudiar dos aspectos importantes de la progresión metastásica: vivienda de células de cáncer o de migración a un órgano específico ( "llegar allí") y el crecimiento en dicho órgano ( "creciendo allí"). Mucho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, the Canada Foundation for Innovation (No. 13199), and donor support from John and Donna Bristol through the London Health Sciences Foundation (to A.L.A.). Studentship and fellowship support were provided by the Ontario Graduate Scholarship program (Province of Ontario, to G.M.P. and J.E.C.), the Canada Graduate Scholarship-Master’s program (to M.M.P), the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (to M.M.P., G.M.P and J.E.C.) and the Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit at the London Regional Cancer Program (to M.M.P., G.M.P., J.E.C. and Y.X.). A.L.A. is supported by a CIHR New Investigator Award and an Early Researcher Award from the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1X Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6-12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1 x Mito+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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