Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi
Summary
This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.
Abstract
Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.
Introduction
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve kansere bağlı ölümlerin 1 ikinci önde gelen nedenidir. Meme kanserinin yüksek ölüm oranı azaltmak ve metastatik hastalığı ortadan kaldırmak için konvansiyonel tedavinin başarısızlığı kaynaklanmaktadır; kansere bağlı ölümlerin yaklaşık% 90 metastazı 2 kaynaklanmaktadır. Metastatik kaskad altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması erken ve geç evre meme kanserinde hem de etkili tedavilerin gelişmesine için her şeyden önemlidir.
Geçmiş araştırmalar meme kanseri metastazı çok adımlı doğasını aydınlatmak yardımcı oldu ve hem kanser progresyonu ve metastaz sonucu kanser hücreleri ve ana bilgisayar ortamında 3 arasındaki etkileşim üzerine büyük ölçüde bağımlı olduğu varsayılmaktadır. Klinik gözlemler, birçok kanser yani organ tropizmini görüntüler olduğunu göstermektedir., Eğilim tercihli cas organs.In özel metastazMeme kanseri, e, hastanın hastalığı genellikle yayılır ya da kemik, akciğer, lenf bezi, karaciğer ve beyinde 4-6 olmak üzere 5 ana sitelerine, metastaz. Birçok teori bu süreci açıklamak için geliştirilmiştir, ama sadece birkaç zaman test dayanmış. 1920'lerde önerilen metastaz Ewing teorisi, metastaz thatthe dağılımı mekanik faktörler kesinlikle nedeniyle hipotezi; Tümör hücrelerinin normal tanımlanan fizyolojik kan akışı desenleri ile vücuda taşınır ve sadece birinci kılcal yatakta tutuklama sayede onlar 7 karşılaşıyoruz. Buna karşılık, Stephen Paget 1889 "tohum ve toprak" hipotezi ek moleküler etkileşimler hayatta kalma ve metastaz büyümesi, kanser hücreleri ( "tohum") Sadece kendilerini kurmak sayede uygun moleküler faktörler üretmek proliferatein organı mikroçevrelerde ( "toprak sorumlu olduğunu öne ") 8. Neredeyse bir yüzyıl sonra, Leonard Weiss altındaDaha önce yayınlanmış otopsi verileri bir meta-analiz aldı ve otopsi sırasında tespit edilen birçok metastatik tümörler metastatik bir organ tropizm yalnız kan akımı desenleri ile belirlenmiştir eğer beklenen beklenen oranlarda bulunduğunu Ewing tahminini doğruladı. Ancak, manyinstances sonra Ewing önerdiği mekanik faktörler 9 tarafından beklenen bazı sitelere oluşan az veya daha fazla metastaz vardı. Bu hesaplar ve teoriler spesifik organ microenvironments yaygınlaştırma desen ve meme kanseri gibi birçok kanser, sonraki büyüme ve hayatta kalma kritik bir rol oynadığını düşündürmektedir.
Geçmiş araştırma çabaları çoğunlukla tümör hücresi kaynaklı faktörlere odaklanmış ve meme kanseri metastazı 10-12 gözlenen Organ tropizm katkıları, organ mikroçevresinin türetilmiş ancak az araştırma araştırdı faktörler kurulması için elverişli bir niş sağlayabileceğinigöğüs kanseri metastazlarının. Bu in vitro organ mikroçevresinin bileşenlerini okuyan teknik sorunlar büyük ölçüde kaynaklanmaktadır.
Mevcut madde, insan meme kanseri hücrelerinin, metastatik davranışına lenf nodülü, kemik, akciğer, beyin çözünür bileşenlerin etkisini incelemek için geniş kapsamlı bir ex vivo model sistemi tarif edilir. Daha önce yapılan çalışmalar, farklı meme kanseri hücre çizgileri in vivo metastatik potansiyelin 13 tekabül organa koşullanmış ortama karşılık olarak hücre hattı spesifik ve organ spesifik malign davranış gösteren göstererek, bu model sistem onaylamıştır. Bu model sistemi, tanımlamak ve meme ve büyümesi, göçü ile ilgili etkiler de dahil olmak üzere, kanser hücrelerinin diğer türlerine, metastatik davranışında önemli bir rol oynayabilir spesifik organ türetilen çözünür faktörleri değerlendirmek, davranış ve gen ekspresyonu gibi kök için kullanılabilir yanı tespiti olarakkanseri için potansiyel yeni tedavi hedefleri. Bu ayrıntılı olarak organ-spesifik metastatik davranışlarını incelemek için ve kanser metastazı sürecini sürüş organ kaynaklı çözünür faktörlerin rolünü değerlendirmek için kullanılabilecek ilk ex vivo model sistemidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metastaz hücresel bir dizi etkinlik doku invazyonu ve uzak tümör kurulması 4,30,31 sonuçta sorumlu olduğu bir karmaşık bir süreçtir. Bu organın belirli bir organ ( "getting there") ve büyüme ( "Orada büyüyen") kanser hücresi güdümlü ya da göç: Burada sunulan ex vivo model sistem metastatik ilerlemesi iki önemli yönlerini incelemek için kullanılabilir. Birçok çalışma, daha önce metastaz sürecine katkıda kanser hücrelerinin kendileri ile ilgili anaht…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, the Canada Foundation for Innovation (No. 13199), and donor support from John and Donna Bristol through the London Health Sciences Foundation (to A.L.A.). Studentship and fellowship support were provided by the Ontario Graduate Scholarship program (Province of Ontario, to G.M.P. and J.E.C.), the Canada Graduate Scholarship-Master’s program (to M.M.P), the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (to M.M.P., G.M.P and J.E.C.) and the Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit at the London Regional Cancer Program (to M.M.P., G.M.P., J.E.C. and Y.X.). A.L.A. is supported by a CIHR New Investigator Award and an Early Researcher Award from the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1X Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6-12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1 x Mito+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), (2014).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)–an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
