Her presenterer vi en protokoll for syntetisering av viruslignende partikler ved bruk av enten baculovirus eller pattedyrekspresjonssystemer, og ultrasentrifugering rensing. Denne meget tilpass tilnærming blir brukt til å identifisere virale antigener som vaksine mål på en sikker og fleksibel måte.
Viruslignende partikler (VLP) og subviral partikler (SVPs) er en alternativ tilnærming til virusvaksine design som gir fordelene av økt biosikkerhet og stabilitet over bruk av levende patogener. Ikke-smittsomme og selvsammen er VLP brukes til å presentere strukturelle proteiner som immunogener, utenom behovet for live patogener eller rekombinante virale vektorer for antigen levering. I denne artikkelen viser vi de ulike stadier av VLP design og utvikling for fremtidige applikasjoner i prekliniske dyreforsøk. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: valg av antigen, ekspresjon av antigenet på cellelinjen av valg, rensing av VLP / SVPs, og kvantifisering for antigen dosering. Vi demonstrerer bruk av både pattedyr- og insektcellelinjer for ekspresjon av de antigenene og vise hvordan metoder varierer i utbytte. Metodikken present kan gjelde for en rekke forskjellige patogener, og kan oppnås ved å erstatte de antigener med immunogent structural proteiner av brukerens mikroorganismen av interesse. VLP og SVPs bistå med antigen karakterisering og utvalg av de beste vaksinekandidater.
Viruslignende partikler (VLP) er en godkjent teknologi for humant vaksinasjon. Faktisk, noen av de mer moderne design lisensierte vaksiner, inkludert humant papillomavirus (HPV) og hepatitt Β (HepΒ) vaksiner benytter denne tilnærmingen. VLP-er dannet av strukturelle proteiner som er i stand til selv-sammenstillingen. De sammensatte partikler ligne virale morfologi, men kan ikke infisere eller reprodusere fordi de mangler virale genomer. VLP kan uttrykkes og renses fra en rekke prokaryote og eukaryote systemer. En gjennomgang av litteraturen viser at ulike uttrykks systemer er ansatt med følgende satser: bakterier – 28%, gjær – 20%, anlegg – 9%, insekt – 28%, og pattedyr – 15% en. Av notatet, er HPV-vaksiner basert på L1 kapsid protein som produseres i gjær (Gardasil) eller i et insekt celle system (Cervarix) 2. HepΒ vaksiner, Recombivax og Engerix-Β, blir også produsert i gjær, og er sammensatt av HepΒ overflateantigen 3, 4.
Vi bruker pattedyr- og insektcelle-ekspresjonssystemer for å produsere VLP som krever ko-ekspresjon av flere strukturelle proteiner for montering. Vårt arbeid fokuserer på å designe, produsere og rensende VLP-baserte vaksiner mot menneskelige patogener: influensavirus, respiratorisk syncytialt virus (RSV), dengue virus (DENV), og chikungunya virus (CHIKV). Våre metoder er fleksibel nok til å tillate ko-ekspresjon av de flere strukturelle proteiner fra multiple ekspresjonsplasmider, eller et enkelt ekspresjonsplasmid (figur 1). Tidligere har vi produsert og renset H5N1 VLP samlet fra co-uttrykk av plasmider som koder influensa hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), og matrise (M1) i humane embryonale nyre 293T celler 5,6. Genene ble kodon-optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller og klonet inn i pTR600, en eukaryot ekspresjonsvektor som inneholder cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig promotor, pluss intron A for å initiere transcription av eukaryote innsatser og bovint veksthormon polyadenylering signal for terminering av transkripsjon 7. En lignende tilnærming ved hjelp av tre-plasmidet ko-ekspresjon av HA, NA (figur 1A) og en annen viral matriks-protein, HIV gag p55, ble benyttet for generering av human sesonginfluensa subtype H3N2 VLP i denne studien, og har vist seg å generere VLP av tilsvarende størrelse som influensa partikler 8. Selv om influensavaksiner overveiende fremkalle anti-HA-antistoffer, tilsetning av influensa-neuraminidase formidler sialidase-aktivitet for å muliggjøre VLP spirende fra transfekterte celler 9 og også presentere ytterligere immunogene mål. For å fremstille RSV-VLP, vi også valgt urelaterte kjerne av HIV Gag å utforme prototypiske vaksiner som presenterer utelukkende RSV overflate glykoproteiner for å ytterligere demonstrere fleksibilitet av VLP i formasjonen ved hjelp av HIV gag, som tidligere beskrevet og karakterisert ved elektronmikroskopi 6,10. andrehar tidligere vist at VLP presentere RSV-glykoproteiner kan settes sammen ved bruk av forskjellige virale komponenter fra Newcastle Disease Virus (NDV) 11, og influensa matrise 12. Full-lengde overflate-glykoprotein sekvenser ble anvendt i denne studien er å beholde innfødte konformasjoner som kan være nødvendige for funksjonell reseptor-binding og antistoffgjenkjenning assay ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA).
Våre eksempler på bruk av enkle plasmid ekspresjonssystemer å generere partikler er DENV og CHIKV. I tilfelle av DENV, kan vi produsere subviral partikler (SVPs) uten kapsid i 293T-celler fra et enkelt plasmid inneholdende et PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassett 13. Uttrykket SVP brukes til å betegne mangelen på en kjerne eller kapsidprotein i monteringen av virale strukturelle proteiner. Chik VLP kan også produseres ved hjelp av et enkelt plasmid som inneholder et CHIKV strukturgenet kassett, koding kapsidbindende og konvolutt proteiner, eller jegnsect celler ved å infisere med et rekombinant baculovirus som koder for den samme strukturelle gen kassett som er optimalisert for insektcelle uttrykket (figur 1 B – C).
Sluttresultatet av uttrykket tilnærminger som er diskutert ovenfor er frigjøring av VLP inn i cellekulturmedium som kan deretter bli renset ved ultrasentrifugering gjennom en 20% glycerol pute. I denne rapporten presenterer vi metoder for å uttrykke og rense disse VLP fra pattedyr og insektcellesystemer.
Vi har brukt de teknikkene som er beskrevet ovenfor for å lykkes uttrykke og rense SVPs og VLP sammensatt av flere strukturelle proteiner av ulike patogener. Vanligvis bruker vi pattedyrekspresjonssystemer å generere våre VLP. Men i våre hender, pattedyr-celle avledet Chik VLP rentene var lave. Chik VLP utbyttet var mer robust når du bruker en rekombinant baculovirus-insektcellesystem. Generelt baculovirus-insektcellesystemer gir høyere mengder av rekombinante proteiner, noe som kan resultere fra de høyere cellet…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å erkjenne de tidligere medlemmene av Ross lab som har hjulpet optimalisere protokoll for maksimal effektivitet og avkastning.
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
DMEM | Cellgro | 10-013 | |
Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
H2SO4 | Sigma | 339741 | |
Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |