Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.
Virüs benzeri partiküller (VLP'ler) ve subviral parçacıkları (SVPs) canlı patojenlerin kullanımı üzerinde artmış biyo-güvenlik ve kararlılık avantajlar sağlar viral aşı tasarımı için alternatif bir yaklaşım bulunmaktadır. Bulaşıcı olmayan ve kendi kendine montaj VLP'ler canlı patojenlerin veya antijen teslimat için rekombinant viral vektörler için ihtiyaç kalmaz, immünojen olarak yapısal proteinleri sunmak için kullanılır. Bu yazıda, klinik öncesi hayvan testleri gelecekteki uygulamalar için VLP tasarım ve geliştirme farklı aşamalarında göstermektedir. Prosedür, aşağıdaki aşamaları içerir: bir antijen dozu için antijenin bir seçim, seçim hücre hattı, VLPler / SVPs saflaştırılmasında antijenin ekspresyonunu ve miktar tayini. Biz antijenlerinin ifadesi için hem memeli ve böcek hücre çizgilerinin kullanımını göstermektedir ve metodolojileri verimle farklılık gösterilmektedir. sunulan yöntem patojenlerin için geçerli olabilir ve immünojenik str antijenleri değiştirilmesi ile elde edilebilirilgi kullanıcının mikroorganizma uctural proteinleri. VLP'ler ve SVPs antijen karakterizasyonu ve en iyi aşı adaylarının seçimi ile yardımcı olur.
Virüs benzeri partiküller (VLP'ler), insan aşılama için onaylanmış bir teknolojidir. Aslında, insan papilloma virüsü (HPV) ve hepatit beta da dahil olmak üzere daha çağdaş lisanslı aşıların, bazı (HepΒ) aşılar bu yaklaşımı kullanır. VLP'ler kendini montaj yapabilen yapısal proteinlerden oluşur. monte parçacıklar viral morfolojileri taklit, ancak enfekte ya da viral genomları eksikliği nedeniyle çoğaltma yapamaz. VLP'ler ifade Prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde bir dizi saflaştırılır. -% 28, maya -% 20, bitki -% 9, böcek -% 28, ve memeli -% 15 1 bakteri: literatürün gözden farklı ekspresyon sistemleri aşağıdaki oranlarda istihdam edildiği saptandı. Dikkat çekici bir şekilde, L1 kapsid proteini göre aşılar mayalar (Gardasil) 'de ya da bir böcek hücre sistemine (Cervarix) 2 üretilir. HepΒ aşılar Recombivax ve Engerix-Β da mayada üretilir ve HepΒ yüzey antijeninin 3 oluşmaktadır4.
Bu montaj için çok sayıda yapısal proteinlerin ko-ifadesini gerektiren VLP'lerini üretilmesi için, memeli ve böcek hücre ifade sistemlerini kullanır. grip virüsü, solunum sinsityal virüs (RSV), dang virüsü (DENV) ve chikungunya virüsü (CHIKV): Çalışmalarımız insan patojenlere karşı tasarımı, üretim ve arıtma VLP-bazlı aşılar üzerinde duruluyor. Bizim yöntemleri birden fazla ekspresyon plazmidleri birden fazla yapısal proteinlerin birlikte ekspresyonu ya da tek bir sentezleme plasmidi (Şekil 1) sağlamak için yeterince esnektir. Daha önce, üretilen ve saflaştırılmış H5N1 VLP'ler insan embriyonik böbrek 293T hücrelerinde 5,6 influenza hemaglutinini (HA), nöraminidaz (NA) ve matris (M + -1) kodlayan plasmidin birlikte ekspresyonundan toplandı. genler, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon-optimize edilmiş ve pTR600, transkripsivonel başlatmak için sitomegalovirüs hemen-erken promoteri artı intron A içeren bir ökaryotik ifade vektörüne klonlanmıştırÖkaryotik ekler ription ve transkripsiyon 7 sonlandırılması için sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali. HA, NA (Şekil 1A) ve alternatif bir viral matriks proteini, HIV gag p55, üç plazmid ko-ifadesini kullanan benzer bir yaklaşım, bu çalışmada, insan mevsimsel grip alt H3N2 VLP'lerin üretimi için kullanılmıştır ve elde gösterilmiştir grip parçacıklar 8 olarak benzer büyüklükteki VLP'ler. Influenza aşıları baskın anti-HA antikor ortaya rağmen, grip nöraminidaz eklenmesi transfekte edilmiş hücrelerin 9 ve ayrıca mevcut olmayan ilave imünojenik hedeflerden filizlenen VLP sağlamak için siyalidaz aktivitesi aracılık eder. RSV VLP'lerini üretmek için, aynı zamanda, daha önce tarif edilen ve elektron mikroskopi 6,10 ile karakterize edilen, ayrıca HIV gag ile VLP'lerin oluşumu esnekliğini göstermek için özel olarak RSV yüzeyi glikoproteinleri mevcut prototip aşı tasarım HIV gag ilgisiz bir çekirdek parçası seçilebilir. DiğerleriDaha önce RSV glikoproteinleri Newcastle hastalığı virüsü (NDV), 11 ve influenza matris 12 çeşitli viral bileşenler kullanılarak monte edilebilir sunulması VLP'ler göstermiştir. Tam uzunlukta yüzeyi glikoproteini sekansları, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile işlevsel bir reseptör bağlanması ve antikor tanıma analizi için gerekli olabilir yerel konformasyonun korumak için bu çalışmada kullanılmıştır.
partikülleri oluşturmak için tekli plazmid sentezleme sistemlerinin kullanımı için örnekler DENV ve CHIKV bulunmaktadır. DENV durumunda, bir prM / e yapısal gen sentezleme kasetini 13 içeren tek bir plazmidden 293T hücrelerinde hiçbir kapsid ile subviral parçacıklar (SVPs) üretebilir. vadeli SVP viral yapısal proteinlerin mecliste bir çekirdek veya kapsid proteini eksikliği belirtmek için kullanılır. CHIK VLP'ler da CHIKV yapısal gen kaseti, kodlayan kapsid ve zarf proteinlerini içeren tek bir plazmid kullanılarak üretilebilir veya ibir rekombinan bakulovirüs böcek hücresi ekspresyon (- Cı Şekil 1B) için optimize aynı yapısal gen kasetinin kodlayan enfekte nsect hücreleri.
Yukarıda ele alındığı yaklaşımları ifade sonuç daha sonra% 20 gliserol tampon ile ultra-santrifüj yoluyla saflaştırılabilir hücre kültür ortamına VLPler sürüm. Bu yazıda, ifade ve memeli ve böcek hücre sistemleri bu VLP'lerini arındırmak için yöntemler sunuyoruz.
Biz başarıyla SVPs ve çeşitli patojenler için birden fazla yapısal proteinlerden oluşan VLP'lerini ifade ve arındırmak için yukarıda açıklanan teknikler kullandık. Genel olarak, bizim VLP'lerini oluşturmak için memeli ifade sistemleri kullanırlar. Ancak, bizim elimizde, memeli hücre CHIK VLP verimleri düşük türetilmiş. Bir rekombinant bakülovirüs-böcek hücre sistemini kullanarak CHIK VLP verim daha güçlü oldu. Genel olarak, bakulovirüs, böcek hücre sistemleri, kontrol altında ve…
The authors have nothing to disclose.
Biz maksimum verimlilik ve verim için protokol optimize yardımcı olmuştur Ross laboratuar öncesinde üyelerini kabul etmek istiyoruz.
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
DMEM | Cellgro | 10-013 | |
Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
H2SO4 | Sigma | 339741 | |
Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |