Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации
Summary
Здесь мы приводим протокол для синтеза вирусоподобных частиц, используя либо бакуловируса или системы экспрессии млекопитающих и очистки ультрацентрифугирования. Этот высоко настраиваемый подход используется для выявления вирусных антигенов в качестве мишеней вакцины в безопасной и гибкой основе.
Abstract
Вирусоподобные частицы (VLP) и субвирусного частицы (СВП) являются альтернативный подход к вирусным конструкции вакцины, которая предлагает преимущества повышенной биологической безопасности и стабильности по сравнению с использованием живых микроорганизмов. Неинфекционные и самосборки, VLPs используются, чтобы представить структурные белки в качестве иммуногенов, обходя потребность живых патогенов или рекомбинантных вирусных векторов для доставки антигена. В этой статье мы покажем различные стадии проектирования и разработки VLP для будущих применений в доклинических испытаний на животных. Процедура включает в себя следующие этапы: выбор антигена, экспрессию антигена в клеточной линии выбора, очистки VLPs / СВП и количественному отношению к антигену дозирования. Показано использование обеих клеточных линий млекопитающих и насекомых для экспрессии наших антигенов и продемонстрировать, как методологии отличаются доходности. Методология, представленная может применяться к различным патогенам и может быть достигнуто путем замены антигенов с иммуногенной улuctural белки микроорганизмов пользователя интерес. VLPs и СВП помочь с антигенной характеризации и отбора лучших вакцин-кандидатов.
Introduction
Вирусные частицы (VLP) являются утвержденной технологии для вакцинации человека. На самом деле, некоторые из более современно лицензированных вакцин, в том числе вируса папилломы человека (ВПЧ) и гепатита В (HepΒ) вакцины используют этот подход. VLPs образуются из структурных белков, способных к самоорганизации. Собранные частицы имитируют вирусные морфологию, но не может инфицировать или репликации, поскольку они испытывают недостаток в вирусных геномов. VLP, может быть экспрессирован и очищен от ряда прокариотических и эукариотических систем. Обзор литературы показал , что различные системы экспрессии используются в следующих размерах: бактерии – 28%, дрожжи – 20%, завод – 9%, насекомых – 28%, а у млекопитающих – 15% 1. Следует отметить, что вакцины против ВПЧ на основе капсидного белка L1 продуцируются в дрожжах (Гардасил) или в системе клеток насекомых (Церварикс) 2. Вакцины HepΒ, Recombivax и Engerix-Β, также производятся в дрожжах, и состоят из HepΒ поверхностного антигена 3, 4.
Мы используем системы экспрессии клеток млекопитающих и насекомых для производства VLPs, требующих совместного экспрессию нескольких структурных белков для сборки. Наша работа сосредоточена на разработке, производстве и очистки VLP на основе вакцин против патогенов человека: вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус денге (DENV), и вирус чикунгуньи (CHIKV). Наши методы являются достаточно гибкими , чтобы обеспечить коэкспрессией многочисленных структурных белков из нескольких плазмид экспрессии, или одной плазмиды экспрессии (рисунок 1). Ранее мы получали и очищали вирус H5N1 VLPs собранный из коэкспрессией плазмид , кодирующих гемагглютинин гриппа (HA), нейраминидаза (NA) и матрица (M1) в эмбриональной почки человека 293Т 5,6. Гены оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих, и клонировали в pTR600, эукариотической вектор экспрессии, содержащий промотор цитомегаловируса немедленного раннего промотора плюс Интрон А для инициирования TransCription эукариотических вставок и бычий сигнал полиаденилирования гормона роста для прекращения транскрипции 7. Аналогичный подход с использованием трех плазмидной коэкспрессии HA, NA (рис 1А) и альтернативного вирусного белка матрикса, ВИЧ Gag p55, был использован для генерации человеческого подтипа сезонного гриппа H3N2 VLPs в данном исследовании , и было показано , для генерации VLPs такого же размера , как частицы гриппа 8. Хотя вакцины против гриппа преимущественно вызывают анти-HA антитела, добавление нейраминидазы вируса гриппа посредничает сиалидазу активность , чтобы позволить VLP многообещающий из трансфецированных клеток 9 , а также представить дополнительные иммуногенных целей. Для получения RSV VLPs, мы также выбрали неродственного ядро ВИЧ Gag для разработки прототипические вакцин , которые представляют исключительно RSV поверхностных гликопротеинов для дальнейшей демонстрации гибкости формирования VLP с использованием ВИЧ – Gag, как описано выше , и характеризуется с помощью электронной микроскопии 6,10. другиеРанее было показано , что VLP , представляя RSV гликопротеины могут быть собраны с использованием различных вирусных компонентов от вируса болезни Ньюкасла (NDV) 11 и матрицы 12 гриппа. гликопротеин последовательности поверхности Полноразмерные были использованы в этом исследовании, чтобы сохранить нативные конформации, которые могут быть необходимы для функционального связывания рецептора и анализа распознавания антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Наши примеры использования отдельных систем плазмида экспрессии для получения частиц являются DENV и CHIKV. В случае DENV, мы можем производить субвирусного частицы (СВП) без капсида в клетках 293Т из одной плазмиды , содержащей кассету экспрессии PRM / Е структурный ген 13. Термин SVP используется для обозначения отсутствия белка ядра или капсида в сборке вирусных структурных белков. CHIK VLP, также могут быть получены с помощью одной плазмиды, содержащей CHIKV структурный ген кассетные, кодирующий капсида и белки оболочки, или в Insect клетки путем инфицирования рекомбинантным бакуловирусом , кодирующей тот же структурный ген , кассету , оптимизированные для экспрессии клеток насекомых (Фиг.1В – C).
Конечный результат выражения рассмотренных выше подходов является высвобождение VLPs в среду для культивирования клеток, которые затем могут быть очищены с помощью ультрацентрифугирования через 20% глицерина демпфировать. В этом отчете мы представляем методы, чтобы выразить и очистить эти VLPs от клеточных систем млекопитающих и насекомых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали методы, описанные выше, чтобы успешно экспрессировать и очистить СВП и VLPs, состоящие из нескольких структурных белков для различных патогенов. В общем, мы используем системы экспрессии в клетках млекопитающих, чтобы произвести наши VLPs. Тем не менее, в наших руках, млекоп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим отметить предыдущие члены лаборатории Росса, которые помогли оптимизировать протокол для максимальной эффективности и доходности.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability – how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- . Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- . Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. . Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
