Здесь мы приводим протокол для синтеза вирусоподобных частиц, используя либо бакуловируса или системы экспрессии млекопитающих и очистки ультрацентрифугирования. Этот высоко настраиваемый подход используется для выявления вирусных антигенов в качестве мишеней вакцины в безопасной и гибкой основе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вирусоподобные частицы (VLP) и субвирусного частицы (СВП) являются альтернативный подход к вирусным конструкции вакцины, которая предлагает преимущества повышенной биологической безопасности и стабильности по сравнению с использованием живых микроорганизмов. Неинфекционные и самосборки, VLPs используются, чтобы представить структурные белки в качестве иммуногенов, обходя потребность живых патогенов или рекомбинантных вирусных векторов для доставки антигена. В этой статье мы покажем различные стадии проектирования и разработки VLP для будущих применений в доклинических испытаний на животных. Процедура включает в себя следующие этапы: выбор антигена, экспрессию антигена в клеточной линии выбора, очистки VLPs / СВП и количественному отношению к антигену дозирования. Показано использование обеих клеточных линий млекопитающих и насекомых для экспрессии наших антигенов и продемонстрировать, как методологии отличаются доходности. Методология, представленная может применяться к различным патогенам и может быть достигнуто путем замены антигенов с иммуногенной улuctural белки микроорганизмов пользователя интерес. VLPs и СВП помочь с антигенной характеризации и отбора лучших вакцин-кандидатов.
Введение
Вирусные частицы (VLP) являются утвержденной технологии для вакцинации человека. На самом деле, некоторые из более современно лицензированных вакцин, в том числе вируса папилломы человека (ВПЧ) и гепатита В (HepΒ) вакцины используют этот подход. VLPs образуются из структурных белков, способных к самоорганизации. Собранные частицы имитируют вирусные морфологию, но не может инфицировать или репликации, поскольку они испытывают недостаток в вирусных геномов. VLP, может быть экспрессирован и очищен от ряда прокариотических и эукариотических систем. Обзор литературы показал , что различные системы экспрессии используются в следующих размерах: бактерии - 28%, дрожжи - 20%,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. млекопитающим Expression System для генерации гриппа H3N2 VLP
- Подклон вирусные структурные гликопротеины гемагглютинин (НА), нейраминидаза (NA), и вирус иммунодефицита человека Затычка р55 (ВИЧ) в эукариотические экспрессирующие векторы, такие , как описано ранее pTR600. 7
- Amplify ДНК в химически компетентной Escherichia coli (например, DH5 & alpha ; ) и изолировать плазмиды трансфекции класса с использованием набора для очистки плазмидной в соответствии с инструкциями изготовителя. Количество ДНК зависит от урожайности и потребностей пользователей.
- Поддержание линии клеток млекопитающих, 293T, в питательной среды....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
выходы VLP были переменными с помощью вирусного антигена дизайн конструкции. В этом протоколе, мы продемонстрировали использование насекомых и млекопитающих клеток для производства СВП или VLPs в супернатанте и очистки с помощью ультрацентрифугирования. Четыре подтипа DENV PRM / E кассет экспрессии структурного гена были использованы для создания версии DenV СВП (разграниченные , как 1-4) в таблице 1 и демонстрируют диапазон между 1.1-2.6 мг общего белка в 0,6 мл объемах.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы использовали методы, описанные выше, чтобы успешно экспрессировать и очистить СВП и VLPs, состоящие из нескольких структурных белков для различных патогенов. В общем, мы используем системы экспрессии в клетках млекопитающих, чтобы произвести наши VLPs. Тем не менее, в наших руках, млекопитающее-клеток, полученную урожайность VLP CHIK были низкими. CHIK выход VLP был более устойчивым при использовании рекомбинантного бакуловируса насекомых клеточной системы. В общем, бакуловирус-системы клеток насекомых, дают более вы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы хотим отметить предыдущие члены лаборатории Росса, которые помогли оптимизировать протокол для максимальной эффективности и доходности.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Многоточечная мешалка Cimarec I 6 | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Ультрацентрифуга Polyclear Пробирки для ультрацентрифуги | Seton | 7025 | Подтвердите подходящие пробирки для ультрацентрифуги и размер ведра |
| Micro BCA Protein Analyzer Набор для анализа белка | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Фосфат цитрат | буфер Sigma | P4922 | |
| о-фенилендиамин дигидрохлорид | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μ m вакуумный фильтр верх (500 мл) | Nalgene | 569-0020 | |
| Глицерин | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Ссылки
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug De....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
