Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.
Abstract
partículas semelhantes a vírus (VLPs) e partículas sub-virais (SVPS) são uma abordagem alternativa para concepção de uma vacina viral que oferece as vantagens de aumento da bio-segurança e estabilidade ao longo do uso de agentes patogênicos vivos. Não infeccioso e a auto-montagem, as VLP são utilizados para apresentar a proteínas estruturais como imunogénios, evitando a necessidade de agentes patogénicos vivos ou vectores virais recombinantes para a entrega de antigénio. Neste artigo, demonstramos as diferentes fases de concepção VLP e desenvolvimento para futuras aplicações em testes em animais pré-clínicos. O procedimento inclui as seguintes fases: selecção do antigénio, a expressão do antigénio na linha de células de escolha, purificação de VLP / SVPS, quantificação e para a dosagem de antigénio. Nós demonstramos a utilização de ambas as linhas celulares de mamífero e de insecto para a expressão de antigénios e os nossos demonstrar como metodologias diferem no rendimento. A metodologia apresentada podem ser aplicadas a uma variedade de agentes patogénicos e pode ser conseguido por substituição dos antigénios imunogénicos com Strproteínas uctural de microorganismo do usuário de interesse. VLP e SVPS auxiliar na caracterização de antigénios e selecção dos melhores candidatos a vacinas.
Introduction
partículas semelhantes a vírus (VLPs) são uma tecnologia aprovado para vacinação humana. Na verdade, algumas das vacinas mais contemporaneamente licenciados, incluindo os vírus do papiloma humano (HPV) e Β hepatite (HepΒ) vacinas empregam esta abordagem. As VLPs são formadas a partir de proteínas estruturais capazes de auto-montagem. As partículas montados imitar morfologias virais, mas não pode infectar ou replicar porque lhes falta genomas virais. VLP pode ser expressa e purificada a partir de um número de sistemas procariotas e eucariotas. Uma revisão da literatura revelou que os diferentes sistemas de expressão são empregadas com as seguintes taxas: bactérias – 28%, a levedura – 20%, planta – 9%, inseto – 28%, e de mamíferos – 15% 1. Digno de nota, as vacinas de HPV com base em proteína da cápside L1 são produzidos em levedura (a vacina) ou num sistema de células de insecto (CERVARIX) 2. Vacinas HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, também são produzidos em levedura, e são compostos de antigénio de superfície 3 HepΒ, 4.
Usamos os sistemas de expressão de células de mamífero e de insecto para produzir VLPs que requerem a co-expressão de várias proteínas estruturais para montagem. O nosso trabalho centra-se na concepção, produção e vacinas baseadas em VLP depurar contra patógenos humanos: vírus influenza, vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da dengue (DENV), e do vírus chikungunya (CHIKV). Os nossos métodos são flexíveis o suficiente para permitir a co-expressão das proteínas estruturais múltiplos a partir de vários plasmídeos de expressão, ou de um único plasmídeo de expressão (Figura 1). Anteriormente, produzida e purificada H5N1 VLP montado a partir da co-expressão de plasmídeos que codificam a hemaglutinina de influenza (HA), neuraminidase (NA), e da matriz (M1) em células 293T de rim embrionário humano 5,6. Os genes foram codões optimizados para a expressão em células de mamífero e clonado em pTR600, um vector de expressão eucariota que contém os citomegalovírus precoce imediato de promotor mais intrão A para iniciar transcription de inserções eucarióticas e o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento bovino para a terminação da transcrição 7. Uma abordagem semelhante utilizando a co-expressão de três plasmídeo de HA, NA (Figura 1A) e uma proteína de matriz viral alternativa, o HIV Gag p55, foi usada para a geração de humano gripe sazonal subtipo H3N2 VLP neste estudo e foi mostrado para gerar VLP de tamanho similar como partículas de influenza 8. Embora as vacinas da gripe predominantemente eliciar anticorpos anti-HA, a adição da neuraminidase da gripe medeia a actividade de sialidase para permitir brotamento VLP a partir de células transfectadas e 9 também são alvos imunogénicos adicionais. Para produzir VLPs de RSV, que também seleccionado o núcleo não relacionados de HIV Gag para conceber vacinas prototípicos que apresentam glicoproteínas de superfície exclusivamente RSV para demonstrar ainda mais a flexibilidade de formação de VLP utilizando HIV Gag, como previamente descrito e caracterizado por microscopia electrónica de 6,10. Outrastêm mostrado previamente que as VLPs apresentando glicoproteínas de RSV pode ser montado utilizando vários componentes virais do vírus da Doença de Newcastle (NDV) 11, e a matriz de influenza 12. sequências de glicoproteína de superfície de comprimento completo foram utilizados neste estudo para reter conformações nativas, que possam ser necessárias para a ligação do receptor funcional e ensaio de reconhecimento do anticorpo por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA).
Os nossos exemplos para a utilização de sistemas de expressão de plasmídeo isolados para gerar partículas são DENV e CHIKV. No caso de DENV, que podem produzir partículas sub-virais (SVPS) sem cápside em células 293T a partir de um único plasmídeo que contém uma cassete de expressão de prM / PT 13 gene estrutural. O termo SVP é utilizada para designar a ausência de uma proteína da cápside do núcleo ou na montagem de proteínas estruturais virais. CHIK VLP também pode ser produzida utilizando um único plasmídeo que contém uma proteína de cassete de genes estruturais, da cápside e de codificação do envelope CHIKV, ou em insect células, infectando com um baculovírus recombinante que codifica a mesma cassete de gene estrutural optimizados para a expressão de células de insecto (Figura 1B – C).
O resultado final da expressão abordagens acima discutidas é a libertação de VLP em meio de cultura celular que pode então ser purificado através de ultracentrifugação através de uma almofada de glicerol 20%. Neste relatório, apresentamos métodos para expressar e purificar estas VLP a partir de sistemas de células de mamíferos e insetos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usámos as técnicas descritas acima para expressar e purificar com êxito SVPS e as VLP compostas por várias proteínas estruturais para vários patogénios. De um modo geral, que utilizam sistemas de expressão de mamífero para gerar nossos VLP. No entanto, em nossas mãos, de células derivadas de mamíferos CHIK rendimentos VLP foram baixos. CHIK rendimento VLP foi mais robusta quando se utiliza um sistema de células de baculovírus de insectos recombinante. Em geral, baculovírus de insecto sistemas de células …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer os membros anteriores do laboratório Ross, que têm ajudado a otimizar o protocolo para a máxima eficiência e produtividade.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
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