يصف هذا البروتوكول استخدام المجهر multiphoton لأداء الموسعة الوقت الفاصل بين التصوير من التفاعلات متعددة الخلايا في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي في قرار خلية واحدة.
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
وقد تبين أن نشر الخلايا السرطانية من الورم الثديية الأساسي لإشراك الخلايا السرطانية فحسب، ولكن الخلايا المضيفة اللحمية بما في ذلك الضامة والخلايا البطانية. وعلاوة على ذلك، ورم الأوعية الدموية غير طبيعي مع زيادة نفاذية 1. وبالتالي، تحديد كيفية الخلايا السرطانية، الضامة، والخلايا البطانية تتفاعل التوسط نفاذية الأوعية الدموية ودخول الوعاء الخلايا السرطانية في المكروية الورم الرئيسي المهم لورم خبيث التفاهم. يمكن فهم حركية نفاذية الأوعية الدموية، دخول الوعاء الخلايا السرطانية وآلية الإشارات الكامنة للتفاعلات متعددة الخلايا في الورم المكروية تقديم معلومات حاسمة في تطوير وإدارة العلاجات المضادة للسرطان.
وكانت الوسيلة الأساسية لدراسة الورم نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي قياس الأصباغ خارج الأوعية مثل ايفانز الزرقاء 2، وارتفاع dextrans الوزن الجزيئي (155 كيلو دالتون)3 وfluorophore أو البروتينات المشع مترافق (بما في ذلك الزلال) 4 في نقطة زمنية محددة بعد حقن الصبغة. التطورات في المجهر، وقد مكنت النماذج الحيوانية والأصباغ الفلورية التصور من العمليات الخلوية ونفاذية الأوعية الدموية في الحيوانات الحية من خلال intravital المجهري 5.
التصوير الحيوانات الحية مع الحصول على صور ثابتة، أو تسلسل قصيرة مرور الزمن على مدى عدة نقاط الوقت لا يسمح لفهم كامل لأحداث ديناميكية في المكروية الورم 6،7. في الواقع، أظهرت ثابت الحصول على الصور على مدار 24 ساعة أن الورم الأوعية الدموية هو المتسرب، ولكن ديناميات نفاذية الأوعية الدموية لم يكن لوحظ 6. وبالتالي، تمديد التصوير المستمر مرور الزمن تصل إلى 12 ساعة يلتقط حركية الأحداث ديناميكية في المكروية الورم.
يصف هذا البروتوكول استخدام الموسعة multiphot الوقت الفاصلعلى intravital المجهري لدراسة أحداث متعددة الخلايا الحيوية في المكروية الورم. وصفت أنواع خلايا متعددة في المكروية الورم مع الأصباغ عن طريق الحقن أو عن طريق استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية. عن طريق الوريد القسطرة ذيل الأصباغ الأوعية الدموية أو البروتينات يمكن حقن بعد بدء التصوير للحصول على البيانات الحركية من أحداث متعددة الخلايا في المكروية الورم. لتصوير الخلايا الحية يتعرض الورم الثديية من خلال إعداد الجراحي رفرف الجلد. يتم الحصول على الصور لمدة تصل إلى 12 ساعة باستخدام مجهر multiphoton مجهزة متعددة أنابيب مضخم (PMT) للكشف عن 8. باستخدام الفلاتر المناسبة، خوارزمية الطرح تمكن 4 أجهزة كشف PMT للحصول على 5 إشارات الفلورسنت في المكروية الورم في وقت واحد 9. عالية الدقة multiphoton حيوي داخلي المجهر يلتقط احد قرار خلية التصوير من التفاعلات ورم سدى في المكروية الورم، مما يؤدي إلى أفضل شnderstanding من نفاذية الأوعية الدموية وورم الخلايا دخول الوعاء 10-13. على وجه التحديد، ممتدة التصوير حيوي داخلي كشفت محلية شديدة، عابرة أحداث نفاذية الأوعية الدموية التي تحدث بشكل انتقائي في مواقع التفاعل بين الخلايا السرطانية، والبلاعم والخلايا البطانية (كما هو موضح المكروية ورم من ورم خبيث، TMEM 14) (13). وعلاوة على ذلك، يحدث دخول الوعاء الخلايا السرطانية فقط في TMEM ومكانيا وزمانيا ترتبط مع نفاذية الأوعية الدموية 13. وقدم قرار خلية واحدة من القوى المحركة لهذه الأحداث من الممكن من خلال استخدام موسع الوقت الفاصل بين multiphoton المجهري للخلايا fluorescently المسمى في المكروية الورم.
التفاعلات الخلوية التي تحدث بشكل عفوي في المكروية الورم يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الحركة الخلايا السرطانية ودخول الوعاء. عالية الدقة حيوي داخلي التصوير من الأنسجة السرطانية الحية يسمح التصور من ديناميات متعددة الخلايا التي يمكن أن تكون 10،13،24 عابرة للغاية. ن…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث من قبل وزارة الدفاع الثدي برنامج أبحاث السرطان تحت رقم جائزة (الرماد، W81XWH-13-1-0010)، المعاهد الوطنية للصحة CA100324، إندستريز CA100324، وبرنامج التصوير المتكاملة.
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
1 x PBS | Life Technologies | ||
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
Oxygen | AirTech | ||
1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |