Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen – Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.
Abstract
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
Introduction
Verbreitung von Tumorzellen von der primären Mammatumor wurde nicht nur Tumorzellen gezeigt einzubeziehen, aber Host stromalen Zellen, einschließlich Makrophagen und Endothelzellen. Darüber hinaus ist Tumorgefäße mit einer erhöhten Permeabilität 1 abnormal. Somit bestimmen, wie Tumorzellen, Makrophagen und endothelialen Zellen in Wechselwirkung treten Gefäßpermeabilität und Tumorzell intravasation in dem primären Tumor-Mikroumgebung zu vermitteln, ist wichtig für das Verständnis der Metastasierung. die Kinetik der vaskulären Permeabilität, Tumorzelle intravasation und dem darunterliegenden Signalisierungsmechanismus von mehrzelligen Interaktionen im Tumormikroumgebung zu verstehen, können wichtige Informationen bei der Entwicklung und Verabreichung von Antikrebstherapien bereitzustellen.
Die primäre Mittel der Tumor vaskuläre Permeabilität in vivo zu studieren die Messung von extravaskulärem Farbstoffe wie Evans – Blau 2, hochmolekulare Dextrane (155 kDa) wurde3 und Fluorophor oder Radiotracer-konjugierte Proteine (einschließlich Albumin) 4 in festen Zeitpunkten nach der Injektion des Farbstoffes. Fortschritte in der Mikroskopie, Tiermodelle und Fluoreszenzfarbstoffe haben die Visualisierung von zellulären Prozessen und vaskuläre Permeabilität in lebenden Tieren durch Intravitalmikroskopie 5 aktiviert.
Live – Tierbildgebung mit dem Erwerb von statischen Bildern oder kurzen Zeitraffer-Sequenzen über mehrere Zeitpunkte nicht für das Verständnis von dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu 6,7 erlauben. Tatsächlich statische Bildaufnahme über den Verlauf von 24 Stunden gezeigt , dass Tumorgefäße undicht jedoch die Dynamik der vaskulären Permeabilität wurde 6 nicht beobachtet. So fängt längere kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung bis zu 12 Stunden, um die Kinetik der dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer multiphotauf Intravitalmikroskopie dynamische vielzelligen Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu studieren. Mehrere Zelltypen in der Tumor-Mikroumgebung mit injizierbaren Farbstoffen markiert oder mit transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine verwenden. einen Schwanzvenenkatheter Gefäß Farbstoffe oder Proteine verwendet, kann nach dem Start der Bildgebung injiziert werden kinetischen Daten von mehrzelligen Ereignisse im Tumormikromilieu zu erwerben. Für Live-Cell-Imaging wird die Brusttumor durch die chirurgische Vorbereitung einer Hautlappen ausgesetzt. Bilder werden für bis zu 12 Stunden erworben 8 eine Multiphotonen – Mikroskop ausgestattet mit mehreren Photovervielfacherröhren (PMT) Detektoren. Durch die Verwendung von geeigneten Filtern ermöglicht eine Subtraktion Algorithmus 4 PMT Detektoren 5 Fluoreszenzsignale im Tumormikromilieu zu erwerben gleichzeitig 9. Hochauflösende Multiintravitalmikroskopie erfasst einzelne Zelle auflösende Bildgebung von Tumor-Stroma-Interaktionen im Tumormikromilieu, zu einem besseren führenden uERSTÄNDIGUNG der vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation 10-13. Insbesondere offenbart verlängerte intravitalAbbildungs stark lokalisierten, transient Gefäßpermeabilität Ereignisse , die selektiv an den Stellen der Interaktion zwischen einer Tumorzelle, einem Makrophagen und einer Endothelzelle (definiert als der Tumor – Mikroumgebung der Metastasierung, TMEM 14) 13 auftreten. Weiterhin tritt Tumorzelle intravasation nur an TMEM und räumlich und zeitlich mit Gefäßpermeabilität 13 korreliert. Einzelne Zell Auflösung der Dynamik dieser Ereignisse wurde möglich durch die Verwendung erweiterter Zeitraffer-Multiphotonen-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen im Tumormikromilieu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zelluläre Interaktionen, die sich spontan in der Tumor-Mikroumgebung auftreten können, auf Veränderungen in der Tumorzellbeweglichkeit und intravasation führen. Hochauflösende intravital Bildgebung von lebenden Tumorgewebe ermöglicht die Visualisierung von mehrzelligen Dynamik , die hochtransienten 10,13,24 sein kann. End-Punkt in – vivo – Tests oder Zeitraffer-Bilder mit diskreten Zeitpunkten erworben wesentlichen Informationen über die molekularen Mechanismen von Prozessen in der Tu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Breast Cancer Research Program unter Verleihungsnummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 und dem Integrated Imaging-Programm unterstützt.
Materials
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1 x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |
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