Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
Verspreiding van tumorcellen van primaire borsttumor is aangetoond dat niet alleen tumorcellen stromale cellen zoals macrofagen en endotheliale cellen omvatten, maar gastheer. Bovendien tumorvasculatuur met abnormaal verhoogde permeabiliteit 1. Aldus bepalen hoe tumorcellen, macrofagen en endotheelcellen interageren vasculaire permeabiliteit en tumorcel intravasation in de primaire tumor micro mediëren van belang voor het begrip metastase. Inzicht in de kinetiek van vasculaire permeabiliteit, tumorcel intravasation en de onderliggende signaleringsmechanisme van meercellige interacties in de tumor micro kan cruciale informatie bij het ontwikkelen en toediening van anti-kankertherapieën.
Het belangrijkste middel van het bestuderen tumor vasculaire permeabiliteit in vivo meten van de extravasculaire kleurstoffen zijn zoals Evans blue 2, hoogmoleculaire dextranen molecuulgewicht (155 kDa)3 en fluorofoor of tracer-geconjugeerde eiwitten (zoals albumine) 4 op vaste tijdstippen na injectie van de kleurstof. De vooruitgang in microscopie, hebben diermodellen en fluorescerende kleurstoffen de visualisatie van cellulaire processen en vasculaire permeabiliteit in levende dieren aanzetten met intravitale microscopie 5.
Levende dieren beeldvorming met de overname van statische afbeeldingen of korte time-lapse sequenties over verschillende tijdstippen niet mogelijk is voor het volledig begrip van dynamische gebeurtenissen in de tumor micro 6,7. Inderdaad, statische beeldacquisitie de loop van 24 uur toonde dat de tumorvasculatuur lekt, maar de dynamiek van vasculaire permeabiliteit werd niet waargenomen 6. Aldus langere continue tijd-lapse imaging tot 12 uur vangt de kinetiek van dynamische gebeurtenissen in de tumor micro-omgeving.
Dit protocol beschrijft het gebruik van verlengde time-lapse multiphotop intravitale microscopie dynamische meercellige gebeurtenissen in de tumor micro bestuderen. Meerdere celtypes in de tumor micro gelabeld met injecteerbare kleurstoffen of in transgene dieren tot expressie fluorescerende eiwitten. Via een staartader katheter vasculaire kleurstoffen of eiwitten kunnen worden geïnjecteerd na het begin van de beeldvorming kinetische gegevens van meercellige gebeurtenissen in de tumor micro verwerven. Voor live cell imaging de borsttumor wordt belicht door de chirurgische voorbereiding van een huid flap. Beelden werden tot 12 uur met een multifoton microscoop uitgerust met meerdere fotomultiplicatorbuizen (PMT) detectors 8. Door gebruikmaking van geschikte filters, een aftrekking algoritme stelt 4 PMT detectors 5 fluorescentiesignalen in de tumor micro gelijktijdig 9 verwerven. Hoge-resolutie multifoton intravitale microscopie vangt enkele cel resolutie afbeelding van tumor-stroma interacties in de tumor micro-omgeving, wat leidt tot een betere understanding van vasculaire permeabiliteit en tumorcel intravasation 10-13. Specifiek uitgebreid intravitale beeldvorming onthulde sterk gelokaliseerde, voorbijgaande vasculaire permeabiliteit gebeurtenissen die selectief plaatsvinden op plaatsen van interactie tussen een tumorcel, een macrofaag en een endotheelcel (gedefinieerd als de tumor micro van metastase, TMEM 14) 13. Bovendien tumorcel intravasation alleen optreedt bij TMEM en ruimtelijk en temporeel gecorreleerd met vasculaire permeabiliteit 13. Enkele cel resolutie van de dynamiek van deze gebeurtenissen is mogelijk gemaakt door het gebruik van verlengde time-lapse multifoton microscopie van fluorescent gelabelde cellen in de tumor micro-omgeving.
Cellulaire interacties die spontaan in de tumor micro-omgeving kan leiden tot veranderingen in motiliteit en tumorcel intravasation. Hoge-resolutie intravitale beeldvorming van levend tumorweefsel maakt de visualisatie van meercellige dynamiek die zeer voorbijgaand 10,13,24 zijn. Eindpunt in vivo testen of time-lapse beelden die met discrete tijdstippen kan essentiële informatie verschaffen over de moleculaire mechanismen van processen in de tumor micro. Intravitale imaging studies zijn gebruikt om …
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door het Ministerie van Defensie Breast Cancer Research Program onder award nummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, en de geïntegreerde Imaging Program.
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
1 x PBS | Life Technologies | ||
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
Oxygen | AirTech | ||
1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |