الخلايا الجذعية وبناء الحصانة المهندسة ضد العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية في نموذج إنساني ماوس
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
مع التطور السريع في العلاجات الجينية على الخلايا الجذعية ضد فيروس نقص المناعة البشرية، هناك ضغط الحاجة إلى نموذج حيواني لدراسة التمايز للدم وظيفة المناعة من الخلايا المعدلة وراثيا. وأنسنة العظام نخاع / الكبد / الغدة الصعترية (التأجير ونقل الملكية) نموذج الفأر يسمح لإعادة الكاملة لنظام المناعة البشري في محيطها، والتي تشمل خلايا تي، الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية وحيدات. زرع الغدة الصعترية البشري كما يسمح لاختيار الغدة الصعترية من خلايا تي في أنسجة الغدة الصعترية ذاتي. بالإضافة إلى دراسة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، ونموذج يقف كأداة قوية لدراسة التفاضل والتنمية وظائف الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). نحن هنا الخطوط العريضة لبناء أنسنة غير البدناء السكري (نود) -severe جنبا إلى جنب العوز المناعي (SCID) جاما المشترك: سلسلة خروج المغلوب (ج γ – / -) الفئران العظم نخاع / الكبد / الغدة الصعترية (مجموعة موردي المواد النووية، التأجير ونقل الملكية) مع HSCs transduced مع CD4 مستقبلات المستضد خيالية (CD4CAR)ناقلات الفيروسة البطيئة. وتبين لنا أن CD4CAR HSCs يمكن أن تفرق بنجاح في الأنساب متعددة ولها نشاط مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. الهدف من هذه الدراسة هو للتدليل على استخدام نموذج الفأر مجموعة موردي المواد النووية، التأجير ونقل الملكية لتكون نموذجا في الجسم الحي للحصانة المهندسة ضد فيروس نقص المناعة البشرية. ومن الجدير بالذكر أن، لأنه يتم استخدام الفيروسة البطيئة والأنسجة البشرية، والتجارب والعمليات الجراحية يجب أن يتم تنفيذ في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية في السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) مع احتياطات خاصة (BSL2 +) المرفق.
Introduction
وعلى الرغم من نجاح العلاج المضاد للفيروسات الرجعية مجتمعة، والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية لا يزال المرض مدى الحياة. الاستجابة المناعية الخلوية ضد فيروس نقص المناعة البشرية تلعب دورا مهما للغاية في السيطرة على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية. وقد سمحت التطورات الحديثة في معالجة الخلايا الجذعية للتنمية السريعة من العلاج الجيني النهج لفيروس نقص المناعة البشرية العلاج 1-3. ونتيجة لذلك، فمن المهم أن يكون هناك نموذج حيواني المناسبة التي تسمح في الدراسة المجراة من فعالية العلاجات المستندة إلى الخلايا ضد فيروس نقص المناعة البشرية.
العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية في النماذج الحيوانية معقد بسبب حقيقة أن الفيروس يصيب فقط الخلايا البشرية. للتحايل على هذا القيد، لجأ العلماء إلى استخدام نماذج الأمراض مثل فيروس نقص المناعة قردي (SIV) في قرود المكاك القرد 4،5. لسوء الحظ، هناك قيود كبيرة في هذا النموذج بسبب الخلافات المتأصلة بين الأنواع والاختلافات بين SIV وفيروس نقص المناعة البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فقط مرافق متخصصة للغاية هي جapable دعم العمل مع الرئيسيات غير البشرية وكل المكاك يتطلب استثمارات كبيرة. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لنموذج التي تستخدم نظام المناعة البشري، الذي هو عرضة لفيروس نقص المناعة البشرية عدوى / المرضية، وأقل باهظة من الناحية المالية.
غير البدناء السكري (نود) -severe جنبا إلى جنب العوز المناعي (SCID) جاما المشترك: سلسلة خروج المغلوب (ج γ – / -) (أو مجموعة موردي المواد النووية) الدم / الكبد / الغدة الصعترية (التأجير ونقل الملكية) ثبت الفأر نموذج إنساني على نحو متزايد أن يكون أداة هامة لدراسة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. من خلال زرع الخلايا المكونة للدم الجذعية (HSCs) والغدة الصعترية الجنين، والفئران قادرة على تطوير وتلخيص نظام المناعة البشري 1-3. نوع واحد من العلاج الجيني على الخلايا الجذعية ينطوي على "إعادة توجيه" خلايا T الطرفية لاستهداف فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق إعادة برمجة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) على التمايز إلى مستضد خلايا T معينة. لقد أظهرنا سابقا أن HSCs الهندسة الجزيئية مع المستنسخة مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية محددة إعادة الخلايا التائيةمتقبل (TCR) ضد حاتمة SL9 (الأحماض الأمينية 77-85. SLYNTVATL) من HIV-1 الكمامة يمكن توجيه الخلايا الجذعية إلى تشكيل خلايا ناضجة تي أن قمع تكرار فيروس نقص المناعة البشرية في أنسنة مجموعة موردي المواد النووية-BLT نموذج الفأر 6. التحذير من استخدام TCR المستنسخة الجزيئي هو أنه يقتصر على سلالة معينة مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) من شأنها أن تحد من تطبيق هذا العلاج. مستقبلات المستضد خيالية (CAR)، من ناحية أخرى، يمكن تطبيقها عالميا لجميع أنواع فرعية HLA. أجريت الدراسات الأولية باستخدام سيارة شيدت مع مجالات خارج الخلية والغشاء من CD4 البشري تنصهر إلى ζ داخل الخلايا مما يشير مجال CD3 (يدعى CD4ζCAR). وأعرب CD4ζCAR على الخلايا التائية CD8 يمكن التعرف على المغلف فيروس نقص المناعة البشرية، وإثارة السامة للخلايا تي استجابة الخلية التي هي مماثلة لتلك بوساطة مستقبلات الخلايا التائية 7. لقد أثبتت مؤخرا أن HSCs الإنسان يمكن تعديلها مع CD4ζCAR، والتي يمكن بعد ذلك تفرق في لى المكونة للدم متعددةneages، بما في ذلك الخلايا T الوظيفية اللازمة للحد من تكرار فيروس نقص المناعة البشرية في نموذج الفأر أنسنة 8. مع التقدم السريع في خيالية العلاجات مستضد مستقبلات لسرطان 9، وتوصيف المستمر قوية الأجسام المضادة تحييد واسعة 10-12 ضد فيروس نقص المناعة البشرية التي تسمح ببناء سيارات الأجسام المضادة سلسلة واحدة، فإنه يمكن إدراكه أن العديد من بنيات مرشح جديدة، بالإضافة إلى CD4ζCAR ، سيتم إنشاء واختبار الخلايا الجذعية العلاج الجيني المعتمد من أمراض نقص المناعة البشرية والأمراض الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للنموذج الفأر مجموعة موردي المواد النووية-BLT أنسنة تحتوي على هذه السيارات مستضد معين توفر أيضا أداة مفيدة لدراسة عن كثب ردود الخلايا التائية البشرية في الجسم الحي. الأهم من ذلك، يختلف بروتوكول لدينا من الأساليب المذكورة السابقة لبناء أنسنة من الفئران BLT 13-15 في أن HSCs في خليط من البروتين هلامي يستخدم بدلا من جذوع الكبد الجنين 16. يصف هذا البروتوكول: 1) بناء حومانيالفئران BLT زيد هندسيا مع CD4ζCAR. و2) توصيف تمايز الخلايا المعدلة وراثيا. و3) توصيف وظائف الخلايا المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع سيارة، وبناء على شهادة الثانوية العامة حصانة المهندسة تكتسب زخما نحو الدراسات السريرية، فمن المهم أن يكون هناك نموذج حيواني المناسبة لدراسة عن كثب التمايز وظيفة هذه الخلايا المهندسة. في هذا البروتوكول وصفنا طرق لبناء واختبار الفئران أنسنة مع المعدلة وراثيا الخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice–an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
