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Bioengineering

Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l'imaging Fisiologicamente parametri importanti Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.

Abstract

Dimostriamo un metodo superiore di 2D immagini spettrali-spaziale di stabili molecole giornalista radicali a 250 MHz con una rapida scansione elettrone-paramagnetica risonanza (RS-EPR), che può fornire informazioni quantitative in vivo condizioni sulla concentrazione di ossigeno, pH, redox lo stato e la concentrazione di molecole di segnale (cioè, OH •, NO •). La tecnica RS-EPR ha una maggiore sensibilità, una migliore risoluzione spaziale (1 mm), e tempo di acquisizione più brevi rispetto alla tecnica standard onda continua (CW). Una varietà di configurazioni fantasma sono stati testati, con risoluzione spaziale variabile da 1 a 6 mm, e la larghezza spettrale delle molecole giornalista vanno da 16 mT (160 mg) a 5 mT (50 G). Un cross-loop risonatore bimodale disaccoppia eccitazione e rilevamento, riducendo il rumore, mentre l'effetto di scansione rapida permette più potenza da immettere nel sistema di spin prima saturazione, aumentando il segnale EPR. Questoporta ad un sostanziale alto rapporto segnale-rumore rispetto esperimenti CW EPR convenzionali.

Introduction

Rispetto ad altri modalità di imaging medico, imaging a risonanza paramagnetica elettronica (EPRI) è l'unica in grado di immagine quantitativamente proprietà fisiologiche tra cui pH 1-3, pO2 4-7 temperatura 8, la perfusione e la vitalità dei tessuti 9, microviscosità e la facilità di diffusione di piccole molecole 10 e lo stress ossidativo 11. Stima della facilità di disolfuro scissione dal glutatione (GSH) nei tessuti e cellule 12,13 può riferire sullo stato redox. Per l'imaging in vivo, EPR nella gamma di frequenza compresa tra 250 MHz e 1 GHz è scelto perché queste frequenze forniscono sufficiente profondità di penetrazione nel tessuto (fino a diverse cm) per generare immagini per piccoli animali in cui intensità non sono diminuite da effetti perdite dielettriche. Frequenze più elevate, ad esempio 9,5 GHz 14 (X-banda) e 17 GHz (K u -BAND) 15,16 possono essere usate per l'imaging di pelle e capelli o celle singoleRispettivamente. Il successo di EPRI a tutte le frequenze dipende sonde di spin paramagnetiche che sono specifici per i tessuti in modo che la loro posizione e il destino Può essere stampato.

Se l'ambiente di una sonda spin elettronico è spazialmente eterogenea, lo spettro EPR è la somma dei contributi di tutte le posizioni. Imaging Spectral-spaziale divide il volume del campione in una serie di piccoli segmenti spaziali e calcola lo spettro EPR per ciascuno di questi segmenti 17. Questo permette mappatura dell'ambiente locale misurando la variazione spaziale nello spettro EPR. gradienti di campo magnetico sono utilizzati per codificare informazioni spaziali in spettri EPR, che sono chiamati proiezioni. L'immagine spettrale-spaziale viene ricostruito da queste proiezioni 18,19.

In RS-EPR il campo magnetico viene analizzato attraverso la risonanza in un tempo che è breve rispetto al tempo di rilassamento spin elettronico (Figura 2) 20,21. D econvolution del segnale rapido scan dà allo spettro di assorbimento, che è equivalente al primo integrale convenzionale spettro CW prima derivata. Il segnale rapida scansione viene rilevato in quadratura, in modo che entrambi i componenti di assorbimento e dispersione della risposta del sistema di spin vengono misurati. Questo è essenzialmente raccogliendo il doppio della quantità di dati per unità di tempo. Saturazione del segnale in un esperimento scansione rapida avviene a potenze superiori che per CW, così potenze superiori possono essere usate senza preoccupazione per la saturazione. 20,22 Molte altre medie può essere fatto per unità di tempo rispetto a CW. maggiore potenza, rilevamento quadratura diretta e più medie per unità di tempo combinano per dare scansione rapida un migliore rapporto (SNR) del segnale-rumore, specialmente di proiezioni alto gradiente che definiscono separazione spaziale, portando a immagini di qualità superiore. Per raggiungere circa lo stesso SNR per l'immagine di un fantasma richiesto circa 10 volte più a lungo per CW come per la scansione rapida 23.

tenda "> La maggiore SNR consente anche esperimenti a 250 MHz con bassa concentrazione di spin trap addotti formati dalla reazione di OH con 5-tert-butossicarbonil-5-metil-1-pyrroline- -oxide N (BMPO-OH), che sarebbe invisibili al metodo CW 24. Dinitroxides collegate con un linker disolfuro sono sensibili al clivaggio da glutatione, e così possono segnalare sullo stato redox cellulare. esiste Equilibrium, dipende dalla concentrazione di glutatione presente, tra le forme di- e mono-radicale. osservando questi cambiamenti richiede cattura dell'intero ampio spettro 5 mT, e può essere realizzato molto più velocemente con la scansione rapida EPR rispetto a intensificare il campo magnetico in un esperimento CW.

Un sistema completo di scansione rapida consiste di quattro parti: Lo spettrometro, il magnete principale campo, il conducente rapida della bobina di scansione e la scansione rapida cross-circuito risonatore. Lo spettrometro e la funzione principale campo magnetico stesso come in un esperimento CW, impostando il campo principale Zeemane raccogliendo i dati dal risonatore. Il driver rapida bobina scansione genera la scansione corrente sinusoidale che va in bobine scansione rapida appositamente progettati sulla scansione rapida cross-circuito risonatore. Le bobine di scansione rapidi alla scansione rapida risuonatore cross-ciclo generano un grande campo magnetico omogeneo, che viene spazzato a frequenze tra 3 e 15 kHz.

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Protocol

1. Installazione del driver Rapid Scan bobina a 250 MHz

  1. Calcolo del Rapid scansione condizioni sperimentali
    Nota: Il parametro più importante RS-EPR è velocità di scansione, α, che è il prodotto della frequenza di scansione e larghezza di scansione (Equazione 3). Per larghezze di scansione strette, velocità di scansione più veloce sono utilizzati, e per larghezze di sweep più ampi, vengono utilizzate velocità di scansione più lenti. Le seguenti istruzioni passo attraverso quest'ultimo caso e mostrano come arrivare ai parametri del driver bobina sperimentali di 7 mt di larghezza sweep e 6,8 kHz frequenza di scansione.
    1. Determinare la larghezza di banda risonatore (BW Res).
      Equazione 1 (1)
      dove v res è la frequenza di funzionamento del risonatore e Q è il fattore di qualità. Q = 90, è comune per il risonatore scansione rapida utilizzata per ottenere i dati in Risultati rappresentativi.
    2. Determinare la frequenza di scansione rapida, α, tuttodovuto dalla larghezza di banda risuonatore Equazione 2 (2)
      Equazione 3

      dove N è una costante spesso conservativamente selezionata per essere in 5-6, ΔB pp è la larghezza di riga derivata picco-picco in mT, e la velocità di scansione se T / s per un linewidth Lorentzian.
      Nota: Un valore comune per i radicali nella sezione rappresentante Equazione 4 = 0,1 mt. In confronto con meno letteratura scansione rapida; Equazione 2 deriva impostando la larghezza di banda del segnale (BW sig) pari a BW Res.
    3. Determinare la frequenza di scansione rapida massimo consentito dal tasso.
      Equazione 5 (3)
      equazione 6
      dove w è la larghezza della scan ed f è la frequenza di scansione. Una larghezza di spazzata 7 mT coprirà il 100% dello spettro per sonde di corrente utilizzati in vivo. Utilizzare questo valore e il tasso calcolato (Equazione 2) per determinare la frequenza di scansione.
      equazione 7
  2. Selezione di condensatori di sintonia e messa a punto di una rapida conducente bobina di scansione
    Nota: Il driver di rapida serpentina di scansione è in genere funzionano in modo risonante generare un'onda sinusoidale. Risonanza avviene ad una frequenza di scansione dove reattanze induttivi e capacitivi sono di ampiezza e opposti segni uguali, in modo che la reattanza totale è vicino a zero.
    1. Determinare la capacità corretta per la frequenza determinata 1.1.3 utilizzando l'induttanza, L, delle bobine di scansione rapida e (Equazione 4).
      equazione 8
      equazione 9
    2. Dividere C TOT da (Equazione 4) a metà per ottenere i valori dei condensatori per ciascun lato della scatola condensatore conducente bobina.
      equazione 10
      equazione 11
      Nota: Il driver rapido bobina di scansione è dotato di due amplificatori. Quando si seleziona un condensatore, la casella condensatore deve essere bilanciato con una capacità uguale su ciascun lato della scatola. Le due parti sono in serie.
    3. Svitare il coperchio superiore della scatola del condensatore e inserire condensatori su entrambi i lati che sono uguali al valore determinato nella fase 1.2.2.
    4. Sostituire la parte superiore della scatola condensatore e avvitare verso il basso per assicurarsi che rimane acceso.
    5. Utilizzando il pannello frontale del conducente coil risonante, regolare la frequenza di uscita fino a che la forma d'onda sinusoidale ha la massima ampiezza.

2. Preparazione dei reagenti e fantasmi

  1. Preparazione di radicals
    1. Rimuovere 15 N-PDT dal congelatore e consentire il contenitore di venire a temperatura ambiente (10-15 min).
    2. Pesare 1,4 mg di 15 N-PDT utilizzando una bilancia analitica.
    3. Aggiungere 1,4 mg di 15 N-PDT a 15 ml deionizzata (DI) H 2 O per una concentrazione finale di 0,5 mM.
      Nota: 4-oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) metil-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-carbamoil-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metil-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) e 3-carbossi-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metil-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-Proxyl) 25 (Figura 1E-G) radicali hanno stabilità a lungo termine (2 anni) in soluzione acquosa e a temperatura ambiente. Le loro forme solide sono generalmente memorizzati in un congelatore o frigorifero per mantenere questi radicali stabile per anni.La stabilità dei radicali nitrossidi generalmente li rendono non tossico, e la loro preparazione può essere fatto su un banco normale quando il solvente è acqua. Quando si usano solventi organici, preparare soluzioni nitrossidi all'interno di una cappa di aspirazione, mentre equipaggiato con il corretto dispositivo di protezione individuale (DPI).
  2. Preparazione del pH sensibile radicali trityl
    1. Pesare 0,7 mg di triaril radicale metile (ATAM 4) 26 radicale (1.400 g / mol) e sciogliere in 200 ml di etanolo assoluto.
    2. Pesare 0,00,681 mila g di KH 2 PO 4 (136,1 g / mol) e sciogliere in 50 ml di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 1 mM.
    3. Pesare 2,8 g di KOH (56 g / mol) e sciogliere in 50 ml di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 1 M.
    4. Aggiungere KOH goccia saggio tampone fosfato (2.2.2) per regolare il pH di 7,0.
    5. Aggiungere 800 ml di tampone fosfato 1 mm e 200 ml di Atam 4 in etanolo assoluto per un conc finaleentration di 0,5 mM in 80:20 buffer: etanolo.
    6. Ripetere i punti 2.2.1-2.2.5 per creare il campione 4 ATAM a pH = 7,2.
    7. Posizionare il ATAM 4, pH = 7.0 e ATAM 4, pH = 7,2 in provette dei campioni di quarzo separati da 6 mm.
    8. Posizionare entrambi i tubi di quarzo EPR 6 mm in un tubo di quarzo EPR 16 mm, con da 2 mm distanziale spessore di polistirolo in mezzo.
      Nota: Le pareti del tubo campione di quarzo sono spessi 0,5 mm, e in aggiunta ai 2 mm distanziale produrre una separazione 3 mm campioni ATAM. I radicali trityl sensibili pH utilizzati sono stati sintetizzati presso l'Ohio State University 26. L'esempio che è stato utilizzato per l'imaging si chiama ATAM 4. La reazione che rappresenta la sensibilità pH è mostrato nella Figura 1A.
  3. Generazione di BMPO-OH
    1. Pesare 680 mg di KH 2 PO 4 e si sciolgono in 100 ml di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 50 mM.
    2. Aggiungere 1 M KOH cadere saggioil tampone fosfato a pH = 7,3.
    3. Pesare 50 mg di BMPO (199,25 g / mol).
    4. Combinare il 50 mg di BMPO con 5 ml di tampone fosfato in un tubo di quarzo irradiazione 16 mm.
    5. Aggiungere 100 ml di acqua ossigenata a 300 mM.
    6. Irradiare la miscela nel tubo di quarzo di irradiazione da 16 mm con una pressione di 450 W lampada media UV per 5 min.
    7. Usando una pipetta di vetro, trasferire 2,5 ml di soluzione irradiato BMPO-OH fuori del tubo di quarzo irraggiamento e in un lato di un tubo campione di quarzo da 16 mm con 3 millimetri divisore.
    8. Trasferire il restante 2,5 ml di irradiato BMPO-OH nell'altro lato della provetta di quarzo da 16 mm con 3 millimetri divisore.
  4. Preparazione di dinitroxide radicale
    1. Pesare 24,7 mg di 2 H, dinitroxide 15 N-disolfuro (Figura 1C) in 1 ml di DMSO per una soluzione stock di 47,5 mm.
    2. Preparare 10 mM tampone Tris e regolare a pH 7,2.
    3. prendere 40ul dinitroxide soluzione madre e diluire con tampone Tris ad una concentrazione finale di 1 mm.
    4. Mettere 250 ml di soluzione dinitroxide in tampone in una provetta di quarzo da 16 mm con un divisore di 10 mm al centro.
    5. Pesare 154 mg di glutatione e aggiungere a 5 ml di tampone Tris per una concentrazione finale di 100 mM.
    6. Aggiungere 5 ml di soluzione 100 mM glutatione per 250 ml di soluzione 1 mM dinitroxide su un lato del divisore 10 mm convertire il diradicale in monoradical.
  5. Preparazione di nitronyl nitrossido
    1. Rimuovere il radicale dal congelatore e consentire il contenitore di venire a temperatura ambiente (10-15 min).
    2. Pesare 1,9 mg di nitronyl (390 g / mol).
    3. Pesare 0,56 mg di KOH e si sciolgono in 10 ml di acqua DI per una concentrazione finale di 1 mM.
    4. Mescolare il 1,9 mg di nitronyl in 10 ml di soluzione 1 mM KOH per una concentrazione finale di 0,5 mM nitronyl.
      Nota: Se necessary, utilizzare un vortex o sonicatore alla velocità solvatazione del nitronyl.

3. Installazione dello strumento rapido di scansione a 250 MHz

Nota: sintonizzazione del risonatore con un campione acquoso del nitrossido radicale, che ha un effetto simile a risuonatore Q e messa in soluzione tampone, è un buon modo per impostare per il campione per essere ripreso

  1. Tune il risonatore con un campione acquoso di nitrossido radicale.
    1. Inserire i 15 ml di 0,5 mm 15 N-PDT in campione di acqua in un tubo di quarzo EPR 16 mm.
    2. Inserire il tubo di quarzo nel lato rilevamento della croce-loop RS-EPR risonatore.
    3. Cambiare la frequenza della sorgente strumento finché non corrisponde alla frequenza del lato rilevamento che contiene il campione. modificare manualmente la frequenza portante della sorgente 250 MHz inserendo il valore desiderato nel software.
    4. Cambiare la frequenza del lato di eccitazione per abbinare i frequencie della sorgente dell'esperimento e lato rilevamento del risonatore. Cambiare la frequenza del lato di eccitazione ruotando un condensatore variabile all'interno della cavità del risonatore secondo il protocollo del produttore.
  2. Impostare Strumento Console e principale Magnete
    1. Accendere lo spettrometro e scegliere un esperimento che registra i dati temporanei nel tempo in ascissa.
    2. All'interno del software, impostare il numero di punti da 65.536 e la base tempo di 10 nsec.
    3. Impostare il numero di calze a 10.000 per un segnale forte o stretto, e 45.000 per un segnale larga o debole.
    4. Premere il tasto "impegnarsi" nel software per inviare i parametri sperimentali dal software alla console ed energizzare il magnete principale campo.
    5. Impostare il campo magnetico principale a 9 mT.
    6. Impostare la manopola di potere attenuazione a 50 dB, e accendere l'amplificatore ad alta potenza 7 W.

4. EsecuzioneEsperimento di Rapid Scan

Nota: le istruzioni specifiche relative all'analisi dei fantasmi contenenti BMPO-OH 24, pH sensibili radicali TAM 19,27 e dinitroxides sensibili redox 28 sono previste in letteratura.

  1. La saturazione di alimentazione di campione nitrossido di serie
    Nota: È vantaggioso fare una curva di saturazione di potenza su un nitrossido campione radicale norma nelle medesime condizioni sperimentali che saranno utilizzati per guardare radicali sensibili al pH o stato redox.
    1. Accendere il driver rapida serpentina di scansione, con i valori dalla sezione 1 (frequenza di scansione di 6,8 kHz e larghezza di scansione di 7 mt).
    2. A partire da 50 dB, raccogliere uno spettro di scansione rapida con 100k medie. Diminuire l'attenuazione di 3 dB e ripetere la misurazione. Continuare fino un'impostazione attenuatore di 0 dB, o finché la misura di isolamento sul display a ponte è <0.
    3. Trasferimento tegli prime dati di scansione rapida in un programma di deconvoluzione (ad esempio scritto in Matlab) ed elaborare i dati grezzi in spettro di assorbimento.
    4. Inserire la frequenza di scansione, la larghezza spazzata, il numero di punti e base dei tempi nel programma, ed eseguire il programma per elaborare il segnale di scansione rapida grezzo in un segnale di assorbimento.
    5. Tracciare l'ampiezza del segnale di assorbimento in funzione della potenza radice quadrata (in Watt) incidente sul risonatore. Nel regime di non saturare, l'ampiezza è linearmente dipendente dalla radice quadrata della potenza incidente.
    6. Montare una linea di tendenza a partire da 0,0 e includere tutti i punti di dati che rientrano nella regione risposta lineare. Nella regione risposta lineare, segnale di ampiezza aumenta proporzionale alla radice quadrata della potenza a microonde.
    7. Estrapolare questa tendenza a potenze superiori, e confrontare l'intensità del segnale EPR. Utilizzare la potenza massima per la quale l'ampiezza del segnale non si discosti più del 3% dalla linea di tendenza estrapolata. in order per la deconvoluzione del segnale di scansione rapida funzioni correttamente, il segnale deve essere ancora nella regione risposta lineare rispetto alla potenza incidente.
      Nota: Il trasferimento dei dati di scansione rapide grezzi può essere fatto tramite una connessione di rete o tramite pen drive. In questo caso il trasferimento è necessario perché il programma per elaborare dati grezzi (Matlab) non è sullo stesso computer che ha software di raccolta dati. L'algoritmo di deconvoluzione che elabora dati grezzi è descritto nel 29.

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Representative Results

Il prodotto dell'esperimento è una serie di sporgenze che vengono ricostruiti in immagini bidimensionali (uno spettrale, uno spaziale) con una scala di falsi colori per rappresentare l'ampiezza del segnale. blu profondo denota linea di base in cui è presente alcun segnale, il verde è bassa ampiezza e il rosso è più alto. Fette lungo l'asse x (dimensione spettrale) raffigurano il segnale EPR (EPR transizione) su un asse del campo magnetico. Lungo l'asse y (dimensione spaziale), la separazione tra i segnali corrisponde alla separazione spaziale fisica tra campioni nei risonatori.

La figura 3 mostra un confronto di due immagini acquisite con CW (Figura 3B) o RS (Figura 3A) di un fantoccio con tre diversi tipi di 15 N radicali nitrossidi sostituiti (Figura 3D). Il segnale più ampia corrisponde a 15 N-Proxyl, un pirrolo cinque membriAnello idine con una carica negativa a pH fisiologico, che potrebbe contribuire a indirizzare la molecola a specifici compartimenti cellulari. Il segnale doppietto appartiene a 15 N-mHCTPO ed è il risultato di una singola idrogeno mezzo altrimenti completa deuterazione. Questo singolo scissione è stato ottimizzato per monitorare i cambiamenti nella concentrazione di ossigeno 30. Il segnale più stretto proviene da 15 N-PDT, un anello di piperidina flessibile, che è completamente deuterato. Può essere utilizzato per monitorare la concentrazione di ossigeno, o l'ambiente redox (riduzione della struttura porta alla diminuzione del segnale EPR).

Per lo stesso tempo di acquisizione di 5 min, l'immagine RS mostra risoluzione spaziale superiore e la chiarezza del modello spettrale per ciascun radicale. Una ragione per il miglioramento della RS oltre CW può essere visto confrontando gli spettri in due diversi punti di forza gradiente tra le due tecniche (Figura 3C). Come il gradiente aumenta la forzail segnale spettrale viene ampliato. Notevole il degrado dello spettro CW sotto le alte pendenze (1 Mt / cm) che codificano le informazioni spaziali.

Poiché un segnale di derivata allarga più rapidamente di un segnale di assorbimento, il SNR per la massima sporgenza CW gradiente (traccia rossa) è molto scarsa rispetto a quella della massima pendenza proiezione RS (traccia blu). Linewidth in funzione della posizione spaziale può essere estratto da una trama 2D. Linewidth sarà ampia o stretta in base a variazioni della concentrazione di ossigeno o la viscosità della sonda nitrossido. Il fantoccio ripreso in Figura 3A era a temperatura ambiente e aperto all'aria. Poiché il contenuto di ossigeno e viscosità (come determinato dalla temperatura) sono rimasti stabili, la larghezza di riga di ciascuna sonda dovrebbe essere costante su tutta la larghezza di ciascun tubo contenente un radicale. Figura 4 mostra la dispersione in linewidths misura da fette attraverso l'immagine 2D rispettoal valore linewidth vero (linea orizzontale nera). I valori fetta immagine, soprattutto per i 15 N-PDT, sono una migliore corrispondenza al vero valore di larghezza di riga per RS (figura 4A) che per CW (Figura 4B). Questo è anche il risultato della migliorato SNR del RS oltre tecnica CW.

Un altro vantaggio della tecnica RS è la capacità di generare larghi magnetici spazza campo omogeneo in un tempo molto breve. Una frequenza di scansione tipica per gli esperimenti a 250 MHz è 9 kHz, corrispondente a 0,11 msec. Si tratta di 0.11 msec se lo sweep campo è di 0,5 mT o 5.0 mt. Confronta questo per CW, dove una spazzata 5,0 mT vorranno decine di secondi a minuti. Con rapida scansione diventa possibile raccogliere rapidamente 100% delle informazioni spettrali in tempi suscettibili di imaging in vivo.

Figura 5 dimostrare ampio spettro RS-EPR iMaging applicata a girare modelli cattura. Molecole di segnalazione importanti, come OH • e NO • sono i radicali liberi endogeni con brevissimi tempi di vita. Per studiare queste molecole, vengono utilizzati "spin trappole". Un esempio di reazione di spin trap 31 (BMPO) con OH • è mostrato in Figura 1B. Imaging di un fantoccio contenente 5 mM BMPO-OH addotto viene mostrato nella Figura 5 (A, B). Il segnale addotto spin-trap dipende dalla concentrazione iniziale di OH • ed ha una emivita di 30 minuti consentendo studio di tutti i processi che generano OH •. Il nitronyl nitoxide 32 è stato usato come un altro esempio di immagini ad ampio spettro, ma è stato utilizzato in passato per spin-cattura di NO • 33,34. Imaging di un fantoccio contenente nitronyl è mostrato in Figura 5 (C, D). per spin trappole, catturano l'intero spettro permette una migliore indicazione delle specie radicaliche transienti originale presente.

La sensibilità ai cambiamenti fisiologici come pH e redox stato deriva da variazioni l'intero spettro. La figura 6 mostra l'imaging con Atam 4. In figura 6B, il profilo di Atam 4 a pH = 7,0 (blu) ha molte caratteristiche spettrali, e una fetta dall'immagine corrisponde bene con il corrispondente spettro gradiente zero (verde). Confrontare questo al profilo di Atam 4 a pH = 7,4, Figura 6C, con meno funzioni spettrali e ancora in buon accordo con il corrispondente spettro del gradiente zero. Imaging di fantasmi contenenti del dinitroxide nella sua dimerica e ridotta forma monomerica sono mostrati in Figura 7. I due spettri differenti sono generati da scissione di un disolfuro (SS), e quindi trasmettere sensibilità redox environment 1,35.

Figura 1
Figura 1. Le sonde EPR sono sensibili a molti cambiamenti fisiologici. (A) Un esempio dei tri-aril-metile (TAM) radicali sensibili al pH 26. (B) trappola Spin BMPO. (C) 15 N-dinitroxide. (D) Il nitronyl. (E) 15 N-Proxyl. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Rapid scansione EPR ha intrinsecamente migliore SNR. (A) In CW EPR l'h ampiezza è una piccola frazione del segnale totale, determinata dalla modulazione del campo magnetico. (B) In scansione rapida diretta rilevato, viene rilevato l'ampiezza totale del segnale. Il segnale di incremento rumore è evidente nella esperimento in cui superossido generato da E. faecalis è intrappolato con BMPO in X-band. Per lo stesso tempo di acquisizione 30 sec, quasi nessun segnale è osservabile nello spettro CW (C), mentre un segnale forte si osserva nello spettro di scansione rapida (D) 36. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Migliorata SNR permette una migliore risoluzione spaziale. Per lo stesso tempo di acquisizione 5 minuti, l'immagine RS ( (B). (C) Vi è un buon accordo tra le proiezioni acquisite con la scansione rapida (blu) e CW (rosso) in assenza di gradiente è presente (0 mt / cm) (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Il contenuto informativo di un'immagine di scansione rapida è superiore a quello per il CW. (A) Fette di dell'immagine 2D RS. (B) Fette di dell'immagine 2D CW. Il vero linewidth (linea orizzontale nera) di ogni campione è indicato per il confronto. Vedi riferimento 23. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. campo Rapid spazzare permette la cattura di un intero spettro in pochi secondi. (A) 2D immagine spettrale spaziale di un fantasma costituito da BMPO-OH addotto. (B) Una misura di simulazione allo zero-gradiente di spettro BMPO-OH a 250 MHz è stata utilizzata per adattare l'immagine iniziale di BMPO-OH e distinguere tra regioni contenenti BMPO-OH e regioni di rumore che contiene. (C) 14 N nitronyl radicale che può essere utilizzato per la cattura di ossido nitrico in vivo. (D) Fette attraverso ogni spettro mostrano la forma spettrale a 250 MHz. Vedi riferimento 19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 6
Figura 6. Nessuna parte dello spettro è lasciato fuori, consentendo un migliore monitoraggio dei cambiamenti spettrali fisiologicamente indotte. Immagine spettrale-spaziale (A) 2D di un fantasma costituito da due tubi di pH sensibile Atam 4 radicale. (B) il profilo spettrale di Atam 4 a pH = 7,0 (blu) e la corrispondente allo zero spettro del gradiente (verde). (C) il profilo spettrale di Atam 4 a pH = 7,4 B (blu) e il corrispondente spettro zero pendenza (verde). Vedere riferimenti 19,26,37. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. scansione rapida apre la porta a in vivo monitoraggio redox a 250 MHz. (A) 2D immagini spettrali-spaziale di 15 N-dinitroxide. (B) Fette attraverso superiore (traccia blu) e in basso (traccia rossa) scomparti nelle due immagini. (C) Il vano superiore rimane la stessa, ma il comparto inferiore è stato ridotto con il glutatione. (D) Fetta attraverso ogni oggetto immagine che mostra la variazione nello spettro 1D del compartimento inferiore. Vedere riferimenti 1,28,35. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

segnali Rapid-scansione hanno componenti di frequenza superiore rispetto CW, e richiedono una larghezza di banda più ampia risuonatore seconda linewidths, tempi di rilassamento, e la velocità dei rapidi-scan. La larghezza di banda richiesta per un dato esperimento si basa sulla larghezza di riga e la frequenza di scansione del campo magnetico (Equazione 2). A seconda dei tempi di rilassamento della sonda in studio (T 2 e T 2 *), e la velocità di scansione, oscillazioni possono apparire sul bordo di uscita del segnale. Per i radicali nitrossidi con T 2 ~ 500 nanosecondi a 250 MHz (57 ° Conferenza Rocky Mountain sulla risonanza magnetica, Epel, B, et al., 2015), velocità di scansione sperimentali spesso non sono abbastanza alto per osservare eventuali oscillazioni.

La larghezza di banda sperimentale è generalmente limitata dalla larghezza di banda risonatore. Ogni semiciclo di un esperimento scansione rapida viene registrato sia con diminuzione o aumento di campo / frequenza, per cui la larghezza di banda sperimentale è ½ tha RESONATOR banda, come mostrato in (Equazione 1). Se la larghezza di banda sperimentale è limitato dalla scelta dei parametri tale che è maggiore di banda risonatore e oscillazioni vengono smorzate, ampliando risultati nella linea deconvolved. Poiché la larghezza di banda esperimento è determinato dal tasso e larghezza di riga del radicale in fase di studio, comprendere queste caratteristiche è un componente chiave dell'esperimento scansione rapida.

Il protocollo attuale dimostra EPRI a 250 MHz di fantasmi contenenti sonde sensibili all'ossigeno, la viscosità, il pH, endogena transitori molecole di segnalazione (vale a dire, OH •, NO •) e lo stato redox. Spaziali risoluzioni tra 1 e 3 mm sono stati dimostrati, con tempi di acquisizione sperimentali tra 29 secondi (linea singola di un 2 linea 15 N spettro, Figura 3) e 15 minuti (intero spettro di 5 micron BMPO-OH, Figura 5). sviluppo del metodo con gli spettacoli Phantomsuso di immagini RS-EPR sostituisce il convenzionale tecnica di imaging CW-EPR 23,24, e apre nuove strade per l'imaging in vivo utilizzando sonde EPR.

EPRI è vantaggioso rispetto ad altre tecniche in vivo in di imaging basate su fluorescenza o fosforescenza, come sonde EPR sono sensibili ad una più ampia varietà di fenomeni in vivo. Inoltre, la penetrazione RF a 250 MHz è ~ 7 cm, in modo che il tessuto anomalo ad un livello più profondo può essere studiato. la risonanza magnetica nucleare (MRI) fornisce mappe anatomiche molto dettagliate, ma si sforza di fornire informazioni fisiologiche quantitativa. Una combinazione di risonanza magnetica e EPRI potrebbe un risultato giorno in una versione tutta risonanza magnetica di una a emissione di positroni-positroni (PET) / tomografia computerizzata (CT) scanner. Tale strumento potrebbe fornire lo stesso beneficio di PET / TC, ma senza le dosi di radiazioni pesanti o costosi di radio-traccianti.

sviluppo di metodi di fantasmi continua a spingere tsi limita di RS-EPR, ma l'obiettivo finale è quello di implementare la tecnica in laboratorio su modelli animali. I calcoli per ricostruzioni di immagini dovranno essere migliorate per velocizzare la raccolta dei dati per un esperimento 4D (3 spaziale, 1 dimensione spettrale). Un algoritmo migliorato è attualmente in fase di sviluppo ed è essenziale per le applicazioni in vivo, ma la prova di principio può essere fatto con immagini 2D.

Molti dei radicali, come ad esempio 15 N-PDT, utilizzati in fantasmi rapidamente degradare in condizioni in vivo con emivita di soli 60 secondi. Radicali con una migliorata resistenza al vivo riduzione 39 sono stati sintetizzati e sono importanti per costruire grandi concentrazioni sufficientemente in vivo. La maggiore sensibilità di RS-EPR su CW-EPR 24 sarà un altro vantaggio nella soluzione di questo problema. La sensibilità di scansione rapida è attualmente 5 mM per un fantasma e tra 100 mM e 5 mM, a secondala sonda di essere ripreso, per studi su animali essere eseguiti presso l'Università di Chicago (comunicazione personale, Maggio, M., 2015). Il metodo RS continuerà ad essere sviluppata per colmare questa lacuna, ma la domanda è già cominciato a muoversi in reale nelle applicazioni in vivo (57 ° Conferenza Rocky Mountain sulla risonanza magnetica, Epel, B, et al., 2015).

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Acknowledgments

Supporto parziale di questo lavoro da NIH concede NIBIB EB002807 e CA177744 (GRE e SSE) e P41 EB002034 di GRE, Howard J. Halpern, PI, e dall'Università di Denver è riconosciuto con gratitudine. Mark Tseytlin è stato sostenuto da NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Gli autori sono grati a Valery Khramtsov, ora presso la University of West Virginia, e Illirian Dhimitruka presso l'Ohio State University per la sintesi delle sensibili radicali TAM pH, e Gerald Rosen e Giuseppe Kao presso l'Università del Maryland per la sintesi del mHCTPO , proxyl, BMPO e radicali nitronyl.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

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References

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Bioingegneria risonanza paramagnetica elettronica (EPR) la scansione rapida nitrossido, 250 MHz il pH la concentrazione di ossigeno stato redox molecole di segnalazione biofisica
Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l&#39;imaging Fisiologicamente parametri importanti<em&gt; In Vivo</em
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