JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em> In Vivo</em

Published: September 26, 2016
doi:
10.3791/54068
, , , , , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory,National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine,Dartmouth University, 4Department of Biochemistry,West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering,University of Denver, 6Department of Engineering,University of Denver

Summary

Um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), rápidas digitalização EPR (RS-EPR), é demonstrado para 2D imagens espaciais espectral, que é superior à técnica tradicional de onda contínua (CW) e abre novos espaços para imagiologia in vivo. Os resultados são demonstrados a 250 MHz, mas a técnica é aplicável em qualquer frequência.

Abstract

Nós demonstramos um método superior de 2D imagem espectral-espacial de moléculas repórter radicais estáveis a 250 MHz usando elétron-paramagnética de ressonância rápida-scan (RS-EPR), que pode fornecer informações quantitativas em condições in vivo na concentração de oxigênio, pH, redox estado e a concentração de moléculas de sinalização (ou seja, OH •, NÃO •). A técnica RS-EPR tem uma maior sensibilidade, uma melhor resolução espacial (1 mM), e tempo de aquisição mais curto, em comparação com a técnica padrão de onda contínua (CW). Uma variedade de configurações de fantasmas foram testados, com resolução espacial variando de 1 até 6 mm, e a largura espectral das moléculas repórter que variam de 16 mT (160 mg) a 5 mT (50 L). Um ressonador bimodal cross-circuito desacopla de excitação e detecção, reduzindo o ruído, enquanto o efeito de verificação rápida permite mais poder para servir de entrada para o sistema de rotação antes da saturação, aumentando o sinal EPR. esteleva a uma proporção substancialmente mais elevada de sinal-para-ruído do que em experiências CW EPR convencionais.

Introduction

Em relação a outras modalidades de imagem médica, imagiologia de ressonância paramagnética eletrônica (EPRI) é o único capaz de imagem quantitativamente propriedades fisiológicas, incluindo pH 1-3, pO 2 4-7, temperatura 8, perfusão e viabilidade dos tecidos 9, microviscosidade e facilidade de difusão de pequenas moléculas 10 e estresse oxidativo 11. Estimativa da facilidade de clivagem dissulfeto de glutationa (GSH) no tecido e células 12,13 pode informar sobre o estado redox. Para imagiologia in vivo, EPR na gama de frequências entre 250 MHz e 1 GHz é escolhido porque estas frequências proporcionar suficiente profundidade de penetração do tecido (até vários centímetros) para gerar imagens para pequenos animais, em que as intensidades não são diminuídas por efeitos de perdas dieléctricas. As frequências mais altas, tais como 9,5 GHz 14 (X-band) e 17 GHz (K u -band) 15,16 pode ser utilizado para imagiologia de pele e cabelo ou células individuais, Respectivamente. O sucesso do EPRI em todas as frequências depende de sondas de spin paramagnéticos que são específicos para os tecidos de modo a que a sua localização e destino pode ser trabalhada.

Se o ambiente de uma sonda de spin do elétron é espacialmente heterogêneo, o espectro EPR é a soma das contribuições de todos os locais. Imagem espectral-espacial divide o volume da amostra em uma matriz de pequenos segmentos espaciais e calcula o espectro de EPR de cada um desses segmentos 17. Isto permite o mapeamento do ambiente local através da medição da variação espacial no espectro de EPR. gradientes de campo magnético são usados ​​para codificar informação espacial em espectros de EPR, que são chamados projecções. A imagem espectral-espacial é reconstruída a partir dessas projeções 18,19.

Na RS-EPR o campo magnético é digitalizado através da ressonância em um tempo que é curto em relação aos tempos de spin do elétron de relaxamento (Figura 2) 20,21. D econvolution do sinal rápida de varrimento dá o espectro de absorção, que é equivalente à primeira integral do espectro CW primeira derivado convencional. O sinal rápida de varrimento é detectada em quadratura, de modo que ambos os componentes de absorção e de dispersão da resposta do sistema de spin são medidos. Isto é, essencialmente, recolhendo o dobro da quantidade de dados por unidade de tempo. A saturação do sinal através de uma experiência de verificação rápida acontece em potências mais elevadas do que para CW, de modo potências mais elevadas podem ser utilizadas sem a preocupação de saturação. 20,22 Muito mais médias pode ser feito por unidade de tempo em comparação com CW. Maior potência, a detecção directa e em quadratura mais médias por unidade de tempo se combinam para dar varredura rápida uma melhor relação sinal-ruído (SNR), especialmente em altas projecções que definem gradientes separação espacial, conduzindo a imagens de maior qualidade. Para atingir aproximadamente o mesmo SNR para uma imagem de um fantasma necessários cerca de 10 vezes mais tempo para CW como para a verificação rápida 23.

tenda "> O aumento da SNR também permite experiências a 250 MHz com aductos de armadilha de spin concentração baixa formados pela reacção de OH com 5-terc-butoxicarbonil-5-metil-1-N-óxido pyrroline- (BMPO-OH), que seria invisíveis para o método CW 24. Dinitroxides ligadas com um ligante dissulfureto são sensíveis à clivagem por glutationa, e assim pode reportar sobre o estado redox celular. existe Equilíbrio, dependente da concentração de glutationa presentes, entre as formas di- e mono-radical. observando estas alterações requer a captura de toda a largura do espectro 5 mT, e pode ser alcançado muito mais rapidamente com EPR varredura rápida em comparação com o reforço do campo magnético através de uma experiência CW.

Um sistema de varredura rápida completa é composta de quatro partes: o espectrômetro, o ímã de campo principal, o motorista bobina varredura rápida, e a varredura rápida cross-circuito ressonador. O espectrómetro e a principal função íman campo o mesmo como numa experiência de CW, definindo o principal campo de Zeemane recolha dos dados do ressonador. O condutor da bobina varredura rápida gera a corrente sinusoidal de digitalização que entra em especialmente concebidos bobinas de verificação rápida sobre a varredura rápida cross-circuito ressonador. As bobinas de verificação rápida sobre a rápida verificação ressonador transversal de circuito gerar um grande campo magnético homogéneo, que é varrida a frequências entre 3 e 15 kHz.

Protocol

1. Configuração do driver rápida verificação da bobina a 250 MHz Cálculo da rápida digitalização condições experimentais Nota: O parâmetro mais importante na RS-EPR é a taxa de varredura, α, que é o produto da freqüência de varredura e largura de varredura (Equação 3). Para larguras de digitalização estreitas, as taxas de digitalização mais rápida são usados, e para larguras de varrimento mais amplos, as taxas de digitalização mais lentas são usadas. As inst…

Representative Results

O produto da experiência é um conjunto de projeções que são reconstruídas em imagens bidimensionais (um espectro, um espacial) com uma escala de cores falsas para representar a amplitude do sinal. azul profundo denota linha de base, onde nenhum sinal estiver presente, o verde é baixa amplitude e vermelho é mais alto. Fatias ao longo do eixo x (dimensão espectral) representam o sinal EPR (transição EPR) sobre um eixo do campo magnético. Ao longo do eixo y (dimensão espacial),…

Discussion

sinais de varredura rápida tem componentes de frequência mais elevadas do que CW, e requerem uma largura de banda ressonador maior dependendo linewidths, tempos de relaxação, ea velocidade das rápidas-scans. A largura de banda necessária para uma dada experiência baseia-se na largura de linha e da velocidade de varrimento do campo magnético (Equação 2). Dependendo dos tempos de relaxação da sonda sob estudo (T 2 e T 2 *), e a velocidade de varrimento, oscilações podem aparecer no bord…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

apoio parcial deste trabalho pelo NIH concede NIBIB EB002807 e CA177744 (GRE e SSE) e EB002034 P41 para GRE, Howard J. Halpern, PI, e pela Universidade de Denver é reconhecido agradecimento. Mark Tseytlin foi financiado pelo NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Os autores são gratos ao Valery Khramtsov, agora na Universidade de West Virginia, e Illirian Dhimitruka da Universidade Estadual de Ohio para a síntese dos radicais TAM sensíveis ao pH, e Gerald Rosen e Joseph Kao na Universidade de Maryland para a síntese do mHCTPO , PROXYL, BMPO e radicais nitronil.

Materials

4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U.Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N Proxyl) N/A N/A Synthesized at U.Maryland and described in reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO)  N/A N/A Synthesized at U.Maryland and described in reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U.Maryland and described in reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor’ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. . Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., Radu, N., Koch, S., et al. . Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 242, (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. . EPR Newsletter. 23, 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Tags

Rapid-scan EPR ImagingRSEPRIElectron Paramagnetic ResonanceOxygen ConcentrationPHRedox StatusSignaling MoleculesBiomedical ResearchCancer ResearchTumor EnvironmentContinuous Wave EPRRapid-scan Experimental ConditionsResonator BandwidthRapid-scan Coil DriverN-15 PDTBMPOHydrogen PeroxideUV Irradiation
check_url/54068?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Biller, J. R., Mitchell, D. G., Tseytlin, M., Elajaili, H., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo. J. Vis. Exp. (115), e54068, doi:10.3791/54068 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image