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Bioengineering

빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다 Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

새로운 전자 상자성 공명 (EPR) 방법, 빠른 스캔 EPR (RS-EPR)는, 기존의 연속파 (CW) 기술보다 우수하고 생체 내 이미징을위한 새로운 장소를 엽니 다 2D 스펙트럼 공간 영상에 대한 설명된다. 결과 250 MHz에서 입증되지만, 기술은 주파수에서 적용 가능하다.

Abstract

우리는 산소 농도, 산도, 산화 환원에 대한 생체 내 조건 하에서 정량 정보를 제공 할 수있는 빠른 주사 전자 상자성 공명 (RS-EPR)를 사용하여 250 MHz에서 안정 라디칼 리포터 분자의 2 차원 스펙트럼 공간적 이미징 우수한 방법을 보여 상태 및 신호 분자의 농도 (즉, OH •, • NO). 는 RS-EPR 기술 표준 연속파 (CW) 기법에 비해 더 높은 감도가 향상된 공간적 해상도 (1 ㎜) 및 짧은 획득 시간을 갖는다. 팬텀 구성 다양한 1~6 mm로 변화하는 공간적 해상도, 16 μT (160 mg)을 5 (MT 50 G)에 이르는 리포터 분자의 스펙트럼 폭을 테스트 하였다. 빠른 스캔 EPR 효과는 신호 증가 더 많은 전력이 포화하기 전에, 스핀 시스템에 입력 할 수 있도록하는 동안 가교 고리 쌍봉 공진기 여진 및 검출, 노이즈 저감을 분리시킨다. 이종래 CW EPR 실험에서보다 실질적으로 더 높은 신호 대 잡음비로 이끈다.

Introduction

다른 의료 영상의 양식을 기준으로, 전자 상자성 공명 영상 (EPRI)는 정량적으로 이미지의 확산의 pH를 1-3, 포 (2) 4-7 온도 (8), 관류와 조직 (9)의 생존, microviscosity 용이성을 포함하여 생리 학적 특성에 유일하게 할 수있다 작은 분자 (10) 및 산화 스트레스 11. 조직에서 글루타치온 (GSH) 세포 (12, 13)에 의해 이황화 분열의 용이성의 평가는 산화 환원 상태를보고 할 수 있습니다. 이러한 주파수는 강도가 유전 손실 효과에 의해 감소되지 않는 작은 동물 용 화상을 생성하는 (수 cm까지) 조직 침투에 충분한 깊이를 제공하기 때문에 생체 내 이미징, 250 MHz 및 1 GHz의 사이의 주파수 범위에서 EPR가 선택된다. 예컨대 9.5 GHz의 14 (X 대역), 17 기가 헤르쯔 (K 유 - 밴드) (15, 16)와 같은 높은 주파수는, 피부, 모발 또는 단일 세포의 영상화에 사용할 수각각. 모든 주파수에서 EPRI의 성공은 자신의 위치와 운명 이미징 될 수 있도록 조직에 대한 특정 상자성 스핀 프로브에 따라 달라집니다.

전자 스핀 프로브의 환경이 공간적으로 불균일 경우 EPR 스펙트럼은 모든 위치의 기여의 합계이다. 스펙트럼 - 공간 영상은 작은 공간 세그먼트의 배열로 샘플의 볼륨을 분할하고,이 세그먼트 (17)의 각각에 대한 EPR 스펙트럼을 계산합니다. 이것은 EPR 스펙트럼의 공간적 변화를 측정하여 로컬 환경을 맵핑 할 수있다. 자기장 기울기는 돌기라고 EPR 스펙트럼으로 공간 정보를 인코딩하기 위해 사용된다. 스펙트럼 - 공간 이미지는이 돌기 (18, 19)에서 재구성된다.

RS-EPR에서 자기장 (그림 2) (20, 21) 전자 스핀 완화 시간에 짧은 상대를하는 시간에 공명을 통해 스캔됩니다. 디 빠른 주사 신호 econvolution 종래 제 파생 CW 스펙트럼의 첫번째 적분 동등 흡수 스펙트럼을 제공한다. 스핀 시스템 응답을 모두 흡수 및 분산 성분이 측정되도록 빠른 주사 신호는 직교 검출된다. 이것은 본질적으로 두 단위 시간당 데이터 양을 수집한다. 더 높은 전력이 포화에 대한 걱정없이 사용할 수 있도록 빠른 스캔 실험 신호의 채도는 CW에 대한보다 높은 전력에서 발생한다. (20, 22)은 더 많은 평균화 CW에 비해 단위 시간당 수행 될 수있다. 높은 전력 직접 직교 검파 및 단위 시간 당 평균보다 높은 품질의 이미지를 초래 특히, 공간 분리를 정의 높은 경사 돌기에서 빠른 스캔 더 나은 신호 대 잡음비 (SNR)를 제공하기 위해 결합한다. 빠른 스캔 23로 CW에 대한 한 약 10 시간을 필요로하는 팬텀의 이미지에 대해 동일한 SNR에 대해 달성했다.

텐트 "> 증가 된 SNR은와 OH의 반응에 의해 형성된 저농도 스핀 트랩 부가 물 250 MHz에서 실험을 허용 5-tert- 부 톡시 -5- 메틸 -1- pyrroline- N의 옥 시드 (BMPO-OH) 될 이황화 링커로 연결된 CW 방법 (24)에 눈에 보이지 않는. Dinitroxides은 글루타티온에 의해 분열에 민감한, 그래서 세포의 산화 환원 상태를보고 할 수 있습니다. 균형이 존재의 디 - 및 모노 급진적 인 형태 사이에, 글루타티온 존재의 농도에 의존한다. 이러한 변화를 관찰하면 전체 5 mT 내지 넓은 범위의 촬영이 필요하고, 실험 CW 자계 스테핑에 비해 빠른 스캔 EPR 훨씬 빨리 달성 될 수있다.

분광계 메인 계자 자석, 빠른 주사 코일 드라이버 및 신속한 스캔 간 루프 공진기 전체 신속한 검사 시스템은 네 개의 부분으로 구성된다. 메인 제만 필드 설정 분광계 및 CW 실험에서와 같은 메인 계자 함수상기 공진기로부터의 데이터를 수집. 빠른 스캔 코일 드라이버는 빠른 스캔 크로스 루프 공진기에 특별히 디자인 된 빠른 스캔 코일에 들어가는 사인 스캔 전류를 생성한다. 빠른 스캔 간 루프 공진기에 급속 주사 코일 (3) 및 15 kHz에서 주파수 스위프 큰 균일 한 자기장을 생성한다.

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Protocol

250 MHz에서 신속한 스캔 코일 드라이버 1. 설치

  1. 빠른 스캔 실험 조건의 계산
    주 : RS-EPR에서 가장 중요한 파라미터는 주파수 스캔 및 스캔 넓이 (수학 식 3)의 제품 스캔 속도, α이다. 좁은 스캔 ​​폭의 경우, 빠른 스캔 속도가 사용되며, 넓은 스윕 폭에 대해, 느린 검색 속도가 사용된다. 다음은 후자의 경우를 단계별로 7 만 T 스위프 폭 6.8 kHz에서 스캔 주파수의 실험 코일 드라이버 매개 변수에 도착하는 방법을 보여줍니다.
    1. 공진기 대역폭 (BW 해상도)를 결정합니다.
      식 (1) (1)
      여기서 V 입술 공진기의 동작 주파수이고, Q는 품질 계수이다. Q = (90)는 대표적인 결과 데이터를 얻기 위해 사용되는 신속한 검색 공진기 일반적이다.
    2. 모든 α, 빠른 스캔 속도를 결정공진기 대역폭 빚 식 (2) (2)
      식 (3)

      N 종종 보수적 5-6로 선택된 정수이고, ΔB의 PP가 mT 내지 피크 - 투 - 피크 선폭 유도체이고, A는 로렌츠 선폭에 대한 T / s의 경우 스캔 속도이다.
      참고 : 대표 섹션에서 라디칼의 일반적인 값은 식 (4) = 0.1 만 T. 이전 신속한 스캔 문헌과 비교; 수학 식 2는 BW 해상도와 동일한 신호 대역폭 (BW 시그마)를 설정함으로써 도출된다.
    3. 속도에 의해 허용되는 최대 빠른 스캔 주파수를 결정합니다.
      식 (5) (삼)
      식 (6)
      여기서 w는 SCA의 폭은N 및 F 스캔 주파수이다. (7) (MT)의 스윕 폭은 생체 내에서 사용되는 전류 프로브, 스펙트럼의 100 %를 커버 할 것이다. 스캔 주파수를 결정하기 위해이 값 (식 2)에서 계산 속도를 사용합니다.
      식 (7)
  2. 동조 커패시터의 선택과 빠른 주사 코일 드라이버 튜닝
    주의 : 급속한 주사 코일 드라이버는 전형적으로 사인파를 발생 공명 모드에서 실행. 공명은 총 리액턴스가 제로에 가까운 있도록 유도 및 용량 성 리액턴스는 동일한 크기와 반대 부호의 수 있습니다 스캔 주파수에서 발생합니다.
    1. 하여 빠른 스캔 코일의 인덕턴스 L을 사용하여 1.1.3에서 결정된 주파수 및 (식 4)에 대한 적절한 용량을 결정합니다.
      식 (8)
      식 (9)
    2. 코일 드라이버 커패시터 상자의 각면에 대한 용량 값을 얻기 위해 반 (식 4)에서의 C TOT 나눈다.
      식 (10)
      식 (11)
      참고 : 빠른 스캔 코일 드라이버가 두 개의 앰프를 가지고있다. 커패시터를 선택했을 때, 용량 상자는 상자의 각면에 동일 용량과 균형을 할 필요가있다. 양측은 시리즈에 있습니다.
    3. 커패시터 상자의 상단 덮개를 풀고 단계 1.2.2에서 결정된 값과 동일 양쪽에 커패시터를 삽입합니다.
    4. 커패시터 상자의 상단을 교체하고이 켜진 상태로 유지하기 위해 그것을 아래로 나사.
    5. 정현파의 최대 진폭을 가질 때까지 공진 된 코일 드라이버의 전면 패널을 사용하여, 출력 주파수를 조정한다.

시약 및 팬텀 2. 준비

  1. 라디에이터의 제조CAL을
    1. 냉장고에서 15 N-PDT를 제거하고 용기를 실온 (10 ~ 15 분)에 올 수 있습니다.
    2. 분석 저울을 사용하여 15 N-PDT의 1.4 밀리그램을 달아.
    3. 0.5 mm의 최종 농도 15 ml의 탈 이온화 (DI) H 2 O 15 N-PDT의 1.4 mg을 추가합니다.
      주 : 4- 옥소 -2,2,6,6- 테트라 (2 H 3) 메틸 -1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1-15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT)를 1 H 4- 메틸 -3- 카르 바 모일 2,2,5,5- 테트라 (2 H 3) 메틸 -3- pyrrolinyloxyl (15-N mHCTPO) 및 3- 카르복시 2,2,5,5- 테트라 (2- H 3) 메틸 -1- (3,4,4- 2 H 3, 1 - 15 N) 피 롤리 (15 N-Proxyl) (25) (그림 1E-G) 라디칼은 수용액에서 장기간 안정성 (2 년)이 있고 실온에서 첨가 하였다. 이들의 고체 형태는 일반적으로 이러한 년간 안정 라디칼을 유지하기 위해 냉동 또는 냉장 보관한다.니트 록 시드 라디칼의 안정성은 일반적으로 그들에게 무독성 만들고, 용매가 물인 경우에 이들의 제조는 통상의 벤치 탑에서 수행 될 수있다. 유기 용제를 사용하는 경우 적절한 개인 보호 장비 (PPE)이 장착하면서, 흄 후드 내에서 질산화물 솔루션을 준비합니다.
  2. 산도 민감한 틸 라디칼의 제조
    1. 급진적 인 트리 아릴 메틸 0.7 밀리그램 (ATAM 4) (26) 라디칼 (1,400g / 몰) 밖으로 달아 무수 에탄올 200 μL에 용해.
    2. KH 2 PO 4 (136.1 g / 몰) 0.00681 g을 달아 최종 농도 1mM, 50 mL의 탈 이온수에 용해.
    3. KOH (56g / 몰) 2.8 g을 달아 1 M.의 최종 농도를위한 DI 물 50ml에 용해
    4. KOH 7.0의 pH를 조정하기 위해 인산 버퍼 (2.2.2)에 적가 추가합니다.
    5. 최종 진한 1 mM의 인산 완충액 800 μL 및 무수 에탄올에 ATAM 4의 200 μl를 추가80:20 버퍼에 0.5 mm의 entration : 에탄올.
    6. 반복의 pH = 7.2에서 ATAM 4 샘플을 만들 수 2.2.1-2.2.5 단계를 반복합니다.
    7. 별도의 6mm 석영 샘플 튜브에 ATAM 4, pH는 7.0, ATAM 4, pH는 7.2를 놓습니다.
    8. 그 사이에 2 mm 두께의 스티로폼 스페이서와 더불어, 16mm 석영 EPR 튜브에 모두 6mm 석영 EPR 튜브를 놓습니다.
      주의 : 샘플을 석영 튜브의 벽은 ATAM 샘플과 3 mm 분리 수율 0.5 mm 두께이고, 2 mm 스페이서 이외에. 사용의 pH에 민감한 트리 틸 라디칼은 오하이오 주립 대학 (26)에서 합성 하였다. 촬상에 사용 된 예 ATAM 4라고한다. pH를 감도를 차지하는 반응은도 1a에 도시된다.
  3. BMPO-OH의 생성
    1. KH 2 PO 4 680 mg의 무게를 50 mM의 최종 농도 100 ml의 탈 이온수에 용해.
    2. 1 M KOH 현명한 드롭 추가pH는 7.3로 인산 버퍼.
    3. BMPO의 50 밀리그램 (199.25 g / 몰)을 달다.
    4. 16mm의 석영 관의 조사 인산 완충액 5 ㎖로 BMPO의 50mg을 결합.
    5. 300 mM의 과산화수소의 100 μl를 추가합니다.
    6. 5 분 동안 중압 450 W의 UV 램프와 16mm의 석영 관의 조사의 혼합물을 조사.
    7. 유리 전달 피펫을 사용하여, 석영 관의 조사 벗어나 3mm 분배기와 16mm 석영 시험관의 한쪽면에 조사 BMPO-OH의 용액 2.5 mL로 옮긴다.
    8. 3mm 분배기와 16mm 석영 샘플 튜브의 다른 측면에 조사 BMPO-OH의 나머지 2.5 ml의 이동.
  4. dinitroxide 라디칼의 제조
    1. 47.5 mm의 원액 1 ml의 DMSO에 2 H 15 N-이황화 dinitroxide (그림 1C)의 24.7 mg의 달다.
    2. 10 mM 트리스 버퍼를 준비하고 pH를 7.2로 조정한다.
    3. (40)을μL은 원액 dinitroxide와 1 mM의 최종 농도 트리스 완충액으로 희석한다.
    4. 중앙에 10mm 분배기와 16mm 석영 샘플 튜브에 버퍼 dinitroxide 용액 250 μl를 놓습니다.
    5. 글루타티온 154 mg의 무게를 100 mM의 최종 농도 트리스 완충액 5 ㎖ 추가.
    6. monoradical 라디칼로 변환 할 10mm 디바이더의 일측에 1 밀리미터 dinitroxide 용액 250 μL의 100 mM의 글루타치온 용액 5 μL를 추가한다.
  5. nitronyl의 질산화물의 제조
    1. 냉장고에서 라디칼을 제거하고 용기를 실온 (10 ~ 15 분)에 올 수 있습니다.
    2. nitronyl (390g / 몰)의 1.9 밀리그램을 달아.
    3. KOH 0.56 ㎎을 칭량을 1 mM의 최종 농도를 위해 10 ml의 탈 이온수에 용해.
    4. 0.5 밀리미터 nitronyl 최종 농도 1 mM의 KOH 용액 10 ㎖로 nitronyl의 1.9 ㎎을 섞는다.
      참고 : necess 경우진은 nitronyl의 속도 매화에 vortexer를 또는 초음파기를 사용합니다.

250 MHz에서 신속한 검사 장비 3. 설정

참고 : 완충 용액으로 공진기 Q 및 조정에 대한 유사한 효과가 급진적 질산화물의 수성 샘플과 공진기의 튜닝 이미지화 할 수있는 샘플 설정하는 좋은 방법입니다

  1. 조정 급진적 질산화물의 수성 샘플 공진기.
    1. 16mm 석영 EPR 튜브에 물 샘플에서 0.5 밀리미터 (15) N-PDT의 15 ml에 삽입합니다.
    2. 크로스 루프 RS-EPR 공진기의 검출면에 석영 관을 삽입한다.
    3. 이 샘플을 포함하는 검출 측의 주파수와 일치 할 때까지 구 소스의 주파수를 변경한다. 수동 소프트웨어에 원하는 값을 입력하여 250 MHz의 소스의 캐리어 주파수를 변경.
    4. FREQUEN 일치 여진 쪽의 주파수를 변경공진기 실험 소스 및 검출 측 CIES. 제조사의 프로토콜에 따라 공진기 내부 가변 캐패시터 돌려 여진 쪽의 주파수를 변경한다.
  2. 악기 콘솔 및 메인 자석을 설정
    1. 분광계를 켜고 가로축에 시간이 임시 데이터를 기록하는 실험을 선택합니다.
    2. 소프트웨어 내 65,536 포인트의 수 10 나노초의 시간 기준을 설정한다.
    3. 강한 좁은 신호 만에 평균의 수를 설정하고 폭 넓은 또는 약한 신호에 대한 45,000한다.
    4. 콘솔 소프트웨어에서 실험 매개 변수를 보내 주 필드 자석에 전원을 공급하기 위해 소프트웨어의 "참여"버튼을 누릅니다.
    5. 9 (MT)에 대한 주요 자기장을 설정합니다.
    6. 50dB의 전원을 감쇠 노브를 설정하고 7 W 높은 파워 앰프의 전원을 켭니다.

4. 실행빠른 스캔 실험의

참고 : BMPO-OH (24)를 포함하는 팬텀의 분석에 관한 구체적인 지시 사항은, pH가 민감한 TAM 라디칼 19,27 및 산화 환원에 민감한 dinitroxides (28)는 문헌에 제공됩니다.

  1. 표준 질산화물 샘플의 전원 포화
    주 : pH와 산화 환원 상태에 민감 라디칼보고하는 데 사용되는 동일한 실험 조건 하에서 기준 샘플 질산화물 라디칼 전력 포화 곡선을 수행하는 것이 유리하다.
    1. 제 1 절 (6.8 kHz에서의 검색 빈도와 7 (MT)의 스캔 폭)의 값으로, 빠른 스캔 코일 드라이버를 켭니다.
    2. 50dB에서 시작, 100,000 평균과 빠른 스캔 스펙트럼을 수집합니다. 3dB에 의해 감쇠를 감소하고 측정을 반복한다. 또는 다리 판독에 절연 측정이 <0만큼 오랫동안 0dB의 감쇠기 설정 될 때까지 계속합니다.
    3. 전송 t그 컨벌루션 프로그램에 원료 빠른 스캔 데이터 (매트랩 작성된 예를 들어)과 흡수 스펙트럼에 대한 원시 데이터를 처리한다.
    4. 프로그램에 포인트와 타임베이스의 스캔 주파수 스위프 폭, 번호를 입력하고 흡수 신호로 원료 빠른 스캔 신호를 처리 할 수있는 프로그램을 실행합니다.
    5. 공진기의 제곱근 (와트)에 입사 전력의 함수로서 흡착 된 신호의 진폭을 그린다. 비 포화 체제에서, 진폭은 입사 전력의 제곱근에 선형으로 의존한다.
    6. 0,0에서 시작하는 추세선을 장착하고 선형 응답 영역에 속하는 모든 데이터 포인트를 포함한다. 선형 응답 영역에서 마이크로파 전력의 제곱근에 비례하는 신호 진폭이 증가한다.
    7. 더 높은 힘이 추세를 추정하고, EPR 신호 강도를 비교합니다. 신호 진폭은 외삽 추세선에서 3 % 이상을 일탈하지 않는 가장 높은 전력을 사용한다. 순으로 하였다정상적으로 동작하는 빠른 스캔 신호의 디콘 볼 루션에 대한 연구는 여전히 입사 신호 전력에 대하여 선형 응답 영역에 있어야한다.
      주 : 원료 빠른 스캔 데이터의 전송은 네트워크 연결을 통해 또는 썸 드라이브를 통해 수행 될 수있다. 이 경우에, 전송은 프로그램이 데이터 수집 소프트웨어가 동일한 컴퓨터에없는 (매트랩) 원 데이터를 처리 할 수 ​​있기 때문에 필요하다. 원시 데이터를 처리 컨벌루션 알고리즘 (29)에 대하여 설명한다.

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Representative Results

실험의 제품은 신호 진폭을 나타내는 위색 스케일 화상 (한 스펙트럼, 하나의 공간) 이차원으로 재구성 돌기의 집합이다. 신호가 존재하지 않는 경우 깊고 푸른는 기본이고, 녹색은 낮은 진폭과 빨간색이 최고입니다. X 축 (스펙트럼 치수)을 따라 조각 자기장 축에서 EPR 신호 (EPR 전이)를 도시한다. Y 축 (공간의 치수)를 따라, 신호들 사이의 간격은 공진기의 샘플 사이의 물리적 공간 간격에 대응한다.

그림 3은 CW (그림 3B) 또는 (15) N 대체 질산화물 라디칼 (그림 3D)의 세 가지 유형과 팬텀의 RS (그림 3A)이 획득 한 두 영상의 비교를 보여줍니다. 가장 광범위한 신호는 15 N-Proxyl, 다섯 멤버 피롤에 해당특정 세포 구획에 분자를 대상으로 도울 수있는 생리 학적 pH에서 음전하를 가진 딘 반지. 겹 신호 (15) N-mHCTPO 속하는 달리 완전한 중수 가운데 하나 수소의 결과이다. 이 단일 분할 산소 농도 (30)의 변화를 모니터링하기 위해 최적화되었다. 좁은 신호는 15 N-PDT, 완전히 중수 소화하는 유연한 피 페리 딘 고리에서 비롯됩니다. 산소 농도, 또는 환원 환경을 모니터링하는데 사용될 수있다 (구조 감소 EPR 신호 감소에 이르게).

같은 5 분의 획득 시간의 경우, RS 이미지는 각각의 라디칼에 대한 스펙트럼 패턴의 우수한 공간 해상도와 선명도를 보여줍니다. CW 통해 RS의 개선의 이유 중 하나는 두 가지 기술 (도 3C) 사이의 두 개의 서로 다른 기울기 강도에서 스펙트럼을 비교함으로써 알 수있다. 그래디언트 강도가 증가함에스펙트럼 신호가 확대된다. 공간 정보를 인코딩 높은 구배 (1 만 T / cm) 아래 CW 스펙트럼의 상당한 저하.

미분 신호 흡수 신호보다 더 빠르게 넓게하므로, 높은 기울기 CW 투영 대한 SNR (적색 트레이스)은 최대 경사 RS 돌기 (블루 추적)에 비해 매우 나쁘다. 공간적 위치의 함수로서 선폭 차원 플롯으로부터 추출 될 수있다. 선폭은 질산화물 프로브 주변의 산소 농도 또는 점도의 변화에 ​​따라 폭 넓은 또는 좁은 될 것입니다. 도 3a에 이미징 팬텀 실온이었다 공기에 개방. 산소 함량 (온도에 의해 측정) 점도가 안정을 유지하기 때문에, 각 프로브의 선폭. 라디칼을 함유하는 각 튜브의 폭에 걸쳐 일정하게도 4 선폭 캐터 비교 차원 영상을 통해 슬라이스로부터 맞게 도시한다진정한 선폭 값 (검은 색 수평 라인)에. 특히 15 N-PDT 용 영상 슬라이스 값은, CW (도 4b)보다 RS (도 4A)에 대한 실제 선폭 값에 더 적합하다. 이것은 또한 CW 방식을 통해 RS의 개선 된 SNR의 결과이다.

중계국 기술의 또 다른 장점은 매우 짧은 시간에 넓은 자성 균질 필드 스위프를 생성하는 능력이다. 250 MHz에서의 실험의 전형적인 주사 주파수는 0.11 밀리 초에 대응하는 9 kHz로한다. 이 필드 스윕 0.5 mT 내지 5.0 mT 내지인지 0.11 msec이다. 5.0 만 T 스윕 분에 수십 초를 취할 것 CW,이 비교. 빠른 스캔으로 신속하게 생체 촬상 의무가있는 시대에 스펙트럼 정보의 100 %를 수집 할 수있다.

그림 5는 다양한 스펙트럼의 RS를-EPR 보여 난maging 트래핑 모델을 회전 적용. OH • 더 • 같은 중요한 신호 분자는 매우 짧은 수명과 내인성 활성 산소이다. 이들 분자를 연구하기 위해, "스핀 트랩"이 사용된다. OH •와 스핀 트랩 (31) (BMPO)의 반응의 예는도 1b에 도시된다. 5 μM BMPO-OH 부가 물을 포함하는 가상의 이미지는도 5의 (A, B)에 나타낸다. 스핀 트랩 부가 신호 OH •의 출발 농도에 의존하고 • OH를 생성하는 과정의 연구 수 30 분의 반감기를 갖는다. nitronyl의 nitoxide 32 광범위한 영상의 또 다른 예로서 사용되었지만, NO • 33,34 스핀 트래핑 위해 과거에 사용되었다. nitronyl을 포함하는 가상의 이미지는도 5의 (C, D)에 도시되어있다. SP의트랩의 전체 스펙트럼을 캡처하는 존재 원래 과도 라디칼 종의 더 나은 지정을 할 수 있습니다.

pH 및 산화 환원 상태와 같은 생리적 변화에 대한 민감도가. 전체 스펙트럼의 변화에서 파생 된 ATAM 4와 6은 영상도있다. 도 6b, pH에서 ATAM 4 프로파일 = 7.0 (청색) 스펙트럼에서 많은 기능을 갖고, 화상으로부터 슬라이스가 대응하는 제로 기울기 스펙트럼 (녹색)과 잘 일치한다. 해당 제로 그라데이션 스펙트럼과 잘 일치 여전히 적은 스펙트럼 기능, pH는 7.4,도 6c에 ATAM (4)의 프로필이 비교합니다. 그 다이머의 dinitroxide의 함유 팬텀의 이미징 및 단량체 형태 감소는 두 개의 다른 스펙트럼 디설파이드 (SS)의 절단에 의해 생성된다.도 7에 도시 등을 산화 환원 ENV 감도 전달되고1,35을 ironment.

그림 1
그림 1. EPR 프로브는 많은 생리적 변화에 민감합니다. (A)에 pH 민감성 트리 아릴 메틸 (TAM) 라디칼 (26)의 예. (B) 스핀 트랩 BMPO. (C) N-15 dinitroxide. (라) nitronyl. (E) (15) N-Proxyl. (F) (15) N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 신속한은 EPR은 본질적으로 더 나은 SNR이 검사합니다. (A) IN CW EPR 진폭 H는 자계 변조 방식에 의해 결정되는 총 신호의 작은 부분이다. 직접 검출 신속한 스캔 (B)는, 전체 신호 진폭이 검출된다. 잡음 상승에 대한 신호는 수퍼 옥사이드가 E. 생성 실험에 분명 칼리스는 X 밴드에서 BMPO에 갇혀있다. 같은 30 초 획득 시간의 경우, 거의 모든 신호가 강한 신호가 빠른 스캔 스펙트럼 (D) (36)에서 관찰되는 동안 CW 스펙트럼 (C)에서 관찰 할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
SNR 개선 된 그림 3. 더 나은 공간 해상도를 할 수 있습니다. 동일한 5 분의 획득 시간의 경우, RS 이미지를 ( (B)을 취득한 것에 비해 공간 해상도를 갖는다. 아니 그라디언트가없는 경우 (C)의 빠른 스캔 (파란색)와 CW (빨간색)으로 얻은 예측과 잘 일치있다 (0 만 T / cm) (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4는 빠른 스캔 화상의 정보 콘텐츠는 CW에 대한 것보다 높다. 차원 화상의 RS (A) 조각. 2 차원 CW 이미지의 (B) 조각입니다. 각 샘플의 실제 선폭 (검은 수평 라인)이 비교를 위해 도시되어있다. (23)을 참조하십시오. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 5
청소 그림 5. 빠른 필드는 몇 초에 전체 스펙트럼을 캡처 할 수 있습니다. BMPO-OH 부가 물로 구성된 팬텀의 (A) 2D 스펙트럼 - 공간 이미지. (B) 250 MHz에서 제로 기울기 BMPO-OH 스펙트럼 시뮬레이션 적합 초기 BMPO-OH 화상을 맞고 BMPO-OH를 포함하는 영역과 잡음 함유 영역을 구별하기 위해 사용되었다. (C) 생체 내에서 산화 질소의 포착에 사용될 수 라디칼 14 N nitronyl. 각각의 스펙트럼을 통해 (D) 조각은 250 MHz에서 스펙트럼 형태를 보여줍니다. (19)을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "ve_content 그림 6
그림 6. 스펙트럼의 어떤 부분은 생리 학적으로 유도 된 스펙트럼의 변화를보다 효율적으로 모니터링을 가능하게 생략한다. (A) 2D 스펙트럼 - 공간 이미지를 급진적 ATAM 4 민감한 pH를 두 튜브로 구성된 팬텀의. (B) pH에서 ATAM 4의 스펙트럼 프로파일 = 7.0 (파란색)와 해당 제로 그라데이션 스펙트럼 (녹색). (C) pH에서 ATAM 4의 스펙트럼 프로파일 = 7.4 B (파란색)와 해당 제로 그라데이션 스펙트럼 (녹색). 참조 19,26,37를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7. 빠른 스캔. 250 MHz에서 생체 내 산화 환원 모니터링에 문을 열어 15 N-dinitroxide의 (A) 2 차원 스펙트럼 - 공간 이미지. (B) 두 이미지의 상단 (블루 추적)과 하단 (빨간색 추적) 구획을 통해 조각입니다. (C)는 상부 격실은 동일하지만 하부 구획 글루타티온 감소되었다. (D) 각 조각 이미지 객체를 통해 하부 격실 (1D)의 스펙트럼의 변화를 도시. 참조를 참조하십시오 1,28,35. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

신속한 스캔 신호는 CW보다 높은 주파수 성분을 가지며, 선폭, 완화 시간에 따라 크게 공진 대역폭 및 급속 주사 속도를 요구한다. 특정 실험에 필요한 대역폭은 선폭 자계 (식 2)의 스캔 속도에 기초한다. 연구중인 프로브의 완화 시간에 따라서 (T 2, T * 2), 및 주사 속도는 발진 신호의 트레일 링 에지에 나타날 수있다. 250 MHz에서 T 2 ~ 500 나노초과 질산화물 라디칼를 들어 (자기 공명 57 일 록키 마운틴 컨퍼런스, EPEL, B, 등., 2015), 실험 스캔 속도는 종종 어떤 진동을 관찰 할 충분하지 않습니다.

실험은 전형적으로 대역폭 공진 대역폭에 의해 제한된다. 빠른 스캔 실험의 각각의 절반 사이클 감소 또는 필드 / 주파수를 증가 하나에 기록되고, 따라서 실험적 대역폭 ½ t 인(수학 식 1)에 나타낸 바와 같이 고 대역폭을 공진기. 실험 대역폭 파라미터의 선택에 의해 제한되는 경우에는, 공진기 대역폭보다 크고 진동이 deconvolved 라인의 결과를 넓혀 감쇠되도록. 실험 대역폭이 연구되고 레이트와 라디칼의 선폭에 의해 결정되기 때문에, 이러한 기능을 이해하는 것은 빠른 스캔 실험의 핵심 구성 요소이다.

현재의 프로토콜은 250 산소, 점도, 산도, 내생 과도 신호 분자에 민감한 프로브를 포함하는 팬텀의 메가 헤르츠 (즉, OH •, • NO) 및 산화 환원 상태에서 EPRI을 보여줍니다. 1 3mm 사이의 공간 해상도를 29 초 (2 라인 (15) N 스펙트럼의 한 줄, 그림 3)과 15 분 사이의 실험 획득 타임이 입증되었다 (의 전체 스펙트럼 5 μM BMPO-OH, 그림 5). 팬텀 쇼와 방법 개발RS-EPR 이미지의 사용은 기존 CW-EPR 이미징 기술 23, 24를 대체하고, EPR 프로브를 사용하여 생체 내 이미징을위한 새로운 길을 엽니 다.

EPR 프로브는 생체 현상의보다 다양한에 민감한으로 EPRI는 형광 또는 인광에 따라 다른 생체 내 이미징 기술을 통해 유리하다. 깊은 수준의 비정상적인 조직을 연구 할 수 있도록 또한 250 MHz에서 RF 침투 ~ 7cm이다. 핵 자기 공명 이미징 (MRI)은 매우 상세 해부학지도를 제공하지만, 정량적 인 생리 학적 정보를 제공하는 투쟁. MRI와 EPRI의 조합 수 양전자 방출 - 단층 촬영 (PET) / 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캐너의 모든 자기 공명 버전의 일일 결과. 이러한 장비는 PET / CT의 동일한 이점을 제공 할 것이나, 무거운 방사선 량 비싼 무선 트레이서없이.

팬텀과 방법의 개발은 t 밀어 계속그는 RS-EPR 한계 있지만, 궁극적 인 목적은 동물 모델을 사용하여 실험실에서 기술을 구현하는 것이다. 이미지 복원에 대한 계산은 4D 실험 (3 공간, 1 스펙트럼 치수)에 대한 데이터 수집 속도를 개선 할 필요가있다. 개선 된 알고리즘은 현재 개발하고, 생체 내 응용 프로그램에 필수적 그러나 원리의 증거가 2D 영상으로 수행 할 수있다되고있다.

팬텀에 사용 된 라디칼, 예컨대 15 N-PDT의 대부분은 60 초 반감기 생체 내 조건에서 빠르게 저하. 생체 감소 (39)에 대한 개선 된 저항 라디칼은 합성 생체 내에서 충분한 농도를 구축하기위한 중요한되고있다. CW-EPR (24)를 통해 RS-EPR의 향상된 감도는이 문제를 해결하는 또 다른 도움이 될 것입니다. 신속한 검사의 감도는 현재 가상 5 μM이고, 100 μM, 5 mM의에 따라프로브는 시카고 대학에서 수행되는 동물 연구에 대해, 묘화 될 (개인 통신, 마지오, M., 2015). RS는 방법이 격차를하기 위해 개발 계속되지만, 응용 프로그램이 이미 생체 내 응용 프로그램에서 실제로 이동하기 시작했다 (57 일 록키 마운틴 컨퍼런스 자기 공명에, EPEL, B, 등., 2015).

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Acknowledgments

NIH에 의해 작품의 부분적인 지원은 GRE, 하워드 J. Halpern, PI에 NIBIB의 EB002807 및 CA177744 (GRE와 SSE)와 P41의 EB002034을 부여하고, 덴버 대학에서 기꺼이 인정한다. 마크 Tseytlin은 NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942에 의해 지원되었다. 저자는 mHCTPO의 합성 산도 민감한 TAM 라디칼의 합성 오하이오 주립 대학에서 지금은 웨스트 버지니아 대학의 발레리 Khramtsov, 및 Illirian Dhimitruka에 감사, 메릴랜드 대학의 제럴드 로젠 조셉 카오에 , proxyl, BMPO 및 nitronyl 라디칼.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

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References

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