Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Summary

Nous décrivons ici un protocole destiné à générer des cellules souches pluripotentes humaines induites par les synoviocytes de type fibroblaste provenant de patients, en utilisant un système lentiviral sans cellules nourricières.

Abstract

cellules somatiques matures peuvent être inversées dans un état de cellules souches pluripotentes comme l'aide d'un ensemble défini de facteurs de reprogrammation. De nombreuses études ont généré induites-cellules souches pluripotentes (CISP) à partir de différents types de cellules somatiques par transduction quatre Yamanaka facteurs de transcription: Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc. L'étude des CSPi demeure à la fine pointe de la recherche biologique et clinique. En particulier, CSPi spécifiques au patient peuvent être utilisés comme un outil d'avant-garde pour l'étude de pathobiologie de la maladie, puisque CSPi peuvent être induites à partir du tissu de tout individu. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, classé par la destruction du cartilage et la structure de l'os dans l'articulation. hyperplasie synoviale est une des raisons majeures ou des symptômes qui conduisent à ces résultats dans la polyarthrite rhumatoïde. Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont les principales cellules du composant dans la synoviale hyperplasique. FLSS dans l'articulation prolifèrent indéfiniment, finalement envahir le cartil adjacentl'âge et de l'os. À l'heure actuelle, la synoviale hyperplasique peut être enlevé que par une intervention chirurgicale. La membrane synoviale enlevée est utilisée pour la recherche RA comme un matériau qui reflète l'état inflammatoire de l'articulation. En tant qu'acteur majeur dans la pathogenèse de la PR, FLSS peut être utilisé comme un matériau pour générer et étudier les CSPi de patients atteints de PR. Dans cette étude, nous avons utilisé le FLSS d'un patient atteint de PR pour générer CSPi. En utilisant un système lentiviral, nous avons découvert que FLSS peut générer RA spécifique au patient iPSC. Les CSPi générées par FLSS peuvent encore être utilisés comme un outil pour étudier la physiopathologie de la PR dans le futur.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes sont la plate-forme de nouvelle génération dans divers domaines cliniques et biologiques. Ils sont un outil prometteur qui peut être utilisé dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et le traitement médical régénérateur. Humaines cellules souches embryonnaires (CSEh) ont été principalement utilisés pour étudier et comprendre les cellules pluripotentes. Cependant, isolé par la destruction du blastocyste humain, CSEh sont associés à plusieurs préoccupations éthiques. En 2007, le Dr Shinya Yamanaka et son équipe inversé le processus de programmation de la cellule et développé des cellules souches à partir de cellules somatiques adultes humaines ^1,2. Par conséquent, contrairement à CSEh, induits-cellules souches pluripotentes (CISP) peuvent être générées à partir de cellules somatiques matures, en évitant les obstacles éthiques.

En règle générale, iPSCs sont générés par la fourniture de quatre gènes exogènes: Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc. Ces facteurs sont à l'origine Yamanaka livrés en utilisant des systèmes lentiviraux et rétroviraux. Les premiers CSPi ont été dérivées de la souris somatique caunes ^3. Par la suite, la technique a été appliquée sur des fibroblastes dermiques humains ^1,2. Des études ultérieures ont généré avec succès iPSCs provenant de diverses sources, telles que l' urine ^4, le sang ^5,6 kératinocytes ⁷ et plusieurs autres types de cellules. Cependant, il y a des cellules somatiques qui ne sont pas utilisés dans la reprogrammation et le dépistage des capacités de reprogrammation de différents types de tissus spécifiques dans l'état de la maladie de cellules, est encore nécessaire.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie qui peut frapper toutes les articulations et entraîner des maladies auto-immunes dans d'autres organes. La polyarthrite rhumatoïde touche environ 1% des adultes dans le monde développé. Il est une maladie assez courante et son incidence augmente chaque année ^8. Cependant, RA est difficile d'identifier dans les premiers stades et oncebone destruction se produit il n'y a pas de traitement qui peut récupérer les dommages. De plus, l'efficacité du médicament diffère d'un patient à, et il est difficile de prédire le médecinine qui est nécessaire. Par conséquent, la mise au point d'une méthode de dépistage de drogue est nécessaire, et un matériau cellulaire qui peut refléter les conditions de la polyarthrite rhumatoïde est nécessaire.

Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont un participant cellulaire actif dans la pathogenèse de la PR ^9,10. FLSS existent dans la paroi de l'intima synoviale entre la capsule et la cavité articulaire, qui est également désigné sous le nom synoviale. En soutenant la structure commune et fournissant des éléments nutritifs au cartilage environnant, FLSS jouent généralement un rôle crucial dans la fonction articulaire et la maintenance. Cependant, FLSS dans la PR ont un phénotype invasif. RA FLSS ont un phénotype de cancer comme, éventuellement détruire l'os environnant par une prolifération infinie ^10. Grâce à cette caractéristique unique FLSS peut être utilisé en tant que matériau prometteur qui peut refléter la pathobiologie de la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, ces cellules sont rarement réalisées, ainsi que les phénotypes cellulaires modifient que les cellules passent par plusieurs passages in vitro </em> conditions. Par conséquent, il peut être compliqué à utiliser RA FLSS comme un outil qui peut représenter l'état du patient.

Théoriquement, RA CSPi patient dérivé (RA-CSPi) peuvent devenir un outil idéal pour le dépistage de drogues et d'autres recherches. CSPi générées ont l' auto-renouvellement et la capacité peuvent être maintenues et développées in vitro. Avec pluripotence, ces cellules peuvent être différenciées en chondrocytes et ostéocytes lignées matures, qui peuvent contribuer matériel cellulaire pour la recherche spécifique dans la polyarthrite rhumatoïde et d' autres maladies liées à l' os ^11.

Dans cette étude, nous montrons comment isoler et développer FLSS d'un synoviale enlevé chirurgicalement, et comment générer RA-CSPi de FLSS utilisant des lentivirus contenant des facteurs Yamanaka.

Protocol

Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861). 1. synoviocytes Isolement et expansion synoviocytes Isolation Stériliser deux paires de ciseaux chirurgicaux et une paire de pinces. Transférer le tissu synovial à 100 mm plat et on lave avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de pénicilline / streptomycine. Coupez les ré…

Representative Results

Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour générer CSPi de FLSS en utilisant un système lentiviral. La figure 1A montre un schéma simple du protocole d'isolement FLS. À la suite de l'ablation chirurgicale de la synovie, le tissu a été haché en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux. Collagénase a été ajouté à isoler les cellules à partir des amas de tissu. Les cellules ont été mises en incubation pendant 14 jours avant le traiteme…

Discussion

Avant la découverte de CSPi, les scientifiques ont utilisé principalement les CES pour étudier la biologie des cellules souches et d'autres lignées cellulaires grâce à la différenciation. Cependant, les CES proviennent de la masse interne d'un blastocyste, qui est un embryon à un stade précoce. Pour isoler les CES, la destruction du blastocyste est inévitable, ce qui soulève des questions éthiques qui sont impossibles à surmonter. En outre, bien que les CES ont des caractéristiques stemness et plur…

Materials

100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/mL)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004