Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell'artrite reumatoide pazienti
Summary
Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali indotte pluripotenti-umani da sinoviociti fibroblasti come derivati da pazienti, utilizzando un sistema lentivirale senza cellule di alimentazione.
Abstract
cellule somatiche maturi possono essere invertiti in uno stato di cellule staminali pluripotenti, come usando un insieme definito di fattori di riprogrammazione. Numerosi studi hanno generato indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) da vari tipi di cellule somatiche da trasduzione quattro fattori di trascrizione Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Lo studio di iPSCs rimane all'avanguardia della ricerca biologica e clinica. In particolare, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati come strumento pionieristica per lo studio della malattia pathobiology, poiché iPSCs possono essere indotte dal tessuto di ogni individuo. L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria cronica, classificati per la distruzione della cartilagine e struttura ossea nelle articolazioni. iperplasia sinoviale è uno dei motivi principali o sintomi che portano a questi risultati in RA. Sinoviociti fibroblasti-like (FLSS) sono le principali cellule del componente della membrana sinoviale iperplastica. FLSS nel giunto senza limiti proliferano, alla fine invadere il cartil adiacenteetà e osso. Attualmente, la membrana sinoviale iperplastica può essere rimosso solo da un intervento chirurgico. La sinovia rimosso viene utilizzato per la ricerca RA come un materiale che riflette la condizione infiammatoria dell'articolazione. Come un giocatore importante nella patogenesi della RA, FLSS può essere utilizzato come materiale per generare e studiare le iPSCs di pazienti affetti da AR. In questo studio, abbiamo usato il FLSS di un paziente RA per generare iPSCs. Utilizzando un sistema lentivirale, abbiamo scoperto che FLSS può generare RA paziente-specifici IPSC. I iPSCs generati da FLSS possono essere ulteriormente utilizzati come strumento per studiare la fisiopatologia della RA in futuro.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti sono la piattaforma di prossima generazione in vari campi clinici e biologici. Sono uno strumento promettente che può essere utilizzato in modelli di malattia, screening di farmaci, e la terapia medica rigenerativa. Umani cellule staminali embrionali (hESC) sono stati utilizzati principalmente per studiare e comprendere le cellule pluripotenti. Tuttavia, isolato dalla distruzione della blastocisti umana, hESC sono associati a diverse preoccupazioni etiche. Nel 2007, il dottor Shinya Yamanaka e il suo team invertito il processo di programmazione delle cellule e hanno sviluppato le cellule staminali adulte da cellule somatiche umane 1,2. Pertanto, a differenza di hESC, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) possono essere generati da cellule somatiche mature, evitando gli ostacoli etici.
Di solito, iPSCs vengono generati con la consegna di quattro geni esogeni: Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questi fattori Yamanaka sono originariamente forniti con sistemi lentivirali e retrovirali. I primi iPSCs sono stati ottenuti da topo somatica cells 3. Successivamente, la tecnica è stata applicata ai fibroblasti dermici umani 1,2. Studi successivi hanno generato con successo iPSCs da varie fonti, come ad esempio urina 4, il sangue 5,6, i cheratinociti 7, e diversi altri tipi di cellule. Tuttavia, ci sono alcune cellule somatiche che non sono stati utilizzati nella riprogrammazione, e lo screening delle capacità riprogrammazione dei vari tipi di cellule provenienti da tessuti specifici in stato di malattia, è ancora necessaria.
L'artrite reumatoide (AR) è una malattia che può colpire tutte le articolazioni e portare a condizioni autoimmuni in altri organi. RA colpisce circa l'1% degli adulti nel mondo sviluppato. Si tratta di una malattia piuttosto comune e la sua incidenza aumenta ogni anno 8. Tuttavia, RA è difficile da individuare nelle fasi iniziali e oncebone distruzione si verifica non esiste alcun trattamento in grado di recuperare il danno. Inoltre, l'efficacia dei farmaci differisce da paziente a paziente, ed è difficile prevedere il medicoine che è richiesto. Pertanto, è necessario lo sviluppo di un metodo di screening droga, ed è richiesto un materiale cella che può riflettere le condizioni di RA.
Sinoviociti fibroblasto-simili (FLSS) sono un partecipante cellulare attivo nella patogenesi di RA 9,10. FLSS esiste nel rivestimento intimale sinoviale tra la capsula articolare e la cavità, che viene indicato anche come sinovia. Sostenendo la struttura comune e fornendo nutrienti alla cartilagine circostante, FLSS di solito giocano un ruolo cruciale nella funzione e la manutenzione delle articolazioni. Tuttavia, FLSS in AR hanno un fenotipo invasivo. RA FLSS hanno un fenotipo cancro-come, eventualmente distruggendo l'osso circostante dalla proliferazione infinita 10. Con questa caratteristica unica, FLSS può essere utilizzato come materiale promettente che può riflettere la pathobiology di RA. Eppure, queste cellule sono raramente prodotte, ei fenotipi cellulari alterano le cellule passano attraverso diversi passaggi in vitro </eM> condizioni. Pertanto, può essere complicato da usare RA FLSS come uno strumento che può rappresentare la condizione del paziente.
Teoricamente, RA iPSCs paziente-derivati (RA-iPSCs) possono diventare uno strumento ideale per lo screening di farmaci e ulteriori ricerche. IPSCs generati hanno la capacità di auto-rinnovamento e possono essere mantenuti e ampliati in vitro. Con pluripotenza, queste cellule possono essere differenziate in maturi condrociti e osteociti lignaggi, che possono contribuire materiale cellulare per la ricerca specifica in AR e altre malattie delle ossa legate 11.
In questo studio, abbiamo dimostrato come isolare ed espandere FLSS da una sinovia rimosso chirurgicamente, e come generare RA-iPSCs da FLSS utilizzando lentivirus contenenti fattori di Yamanaka.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prima della scoperta di iPSCs, gli scienziati hanno utilizzato principalmente CES per studiare la biologia delle cellule staminali e di altre linee cellulari attraverso la differenziazione. Tuttavia, CES provengono dalla massa interna della blastocisti, che è un embrione in fase iniziale. Per isolare CES, la distruzione della blastocisti è inevitabile, sollevando questioni etiche che sono impossibili da superare. Inoltre, anche se i CES hanno caratteristiche di staminalità e pluripotenza, non possono essere ottenuti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
