Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi
Summary
Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.
Abstract
Olgun somatik hücre yeniden programlama faktörleri tanımlanmış bir dizi kullanarak pluripotent kök hücre benzeri duruma ters çevrilebilir. Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc: Çeşitli çalışmalar, dört Yamanaka transkripsiyon faktörlerini transducing çeşitli somatik hücre tiplerinden kaynaklı-pluripotent kök hücreleri (iPSCs) yarattı. iPSCs çalışma, biyolojik ve klinik araştırmaların kesme kenarında kalır. iPSCs herhangi bir bireyin dokusundan indüklenebilir yana Özellikle, hastaya özel iPSCs, hastalık patobiyolojisi çalışma için öncü bir araç olarak kullanılabilir. Romatoid artrit (RA) eklem kıkırdak ve kemik yapısının bozulmasına sınıflandırılan kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Sinovyal hiperplazi RA'da bu sonuçlara yol önemli nedenlerinden veya belirtilerden biridir. Fibroblast benzeri sinoviyositler (FLSs) hiperplastik sinovyumda ana bileşeni hücrelerdir. eklemde FLSs limitlessly sonunda komşu cartil işgal prolifereyaş ve kemik. Şu anda, hiperplastik sinovyum, sadece cerrahi bir prosedür ile çıkarılabilir. Kaldırılan sinovya ortak inflamatuar durumunu yansıtan bir malzeme olarak RA araştırma için kullanılmıştır. RA patogenezinde önemli bir oyuncu olarak, FLSs oluşturmak ve RA hastalarının iPSCs araştırmak için bir malzeme olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, iPSCs oluşturmak için bir RA hastanın FLSs kullanılır. lentiviral sistemi kullanarak, FLSs RA hastaya özgü IPSC oluşturabilir keşfetti. FLSs oluşturulan iPSCs gelecekte daha da RA patofizyolojisinin incelemek için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Pluripotent kök hücreler çeşitli klinik ve biyolojik alanlarda yeni nesil platform vardır. Bu hastalığın modelleme, ilaç tarama, ve rejeneratif tıbbi tedavide kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. İnsan Embriyonik Kök Hücreler (hESC) esas çalışma ve pluripotent hücreler anlamak için kullanıldı. Bununla birlikte, insan blastosist imha ile izole edilmiş, HESC çok etik kaygılar ile ilişkilidir. 2007 yılında, Dr. Shinya Yamanaka ve ekibi hücre programlama sürecini tersine insan yetişkin somatik hücre 1,2 kök hücre geliştirdi. Bu nedenle, HESC farklı olarak, indüklenen-kök hücreleri (iPSCs) etik engel kaçınarak olgun somatik hücrelerinden üretilebilir.
Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc: Genellikle, iPSCs dört ekzojen genlerin verilmesi ile elde edilir. Bunlar Yamanaka faktörleri aslında lentiviral ve retroviral sistemler kullanılarak teslim edilir. İlk iPSCs fare somatik C elde edilmiştirarşın 3. Daha sonra, bu teknik, insan dermal fibroblastlarında 1,2 uygulanmıştır. Daha sonraki çalışmalar başarıyla idrar 4 kan 5,6 gibi çeşitli kaynaklardan iPSCs üretilen 7 keratinositler, ve çeşitli diğer hücre türleri. Bununla birlikte, bazı somatik yeniden programlama kullanılan edilmemiş hücreler ve hastalık durumunda özel dokularda çeşitli hücre tiplerinin yeniden programlama yetenekleri tarama vardır hala gereklidir.
Romatoid artrit (RA), tüm eklemleri grev ve diğer organlarda otoimmün koşullara yol açabilecek bir hastalıktır. RA gelişmiş dünyada erişkinlerin yaklaşık% 1'ini etkiler. Bu oldukça yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı her yıl 8 artar. Ancak, RA erken evrelerde tespit etmek zordur ve yıkım oncebone zarar kurtarabilirsiniz hiçbir tedavi yoktur oluşur. Ayrıca, ilacın yararını hastadan hastaya farklılık gösterir ve Medic tahmin etmek zorgereklidir ine. Bu nedenle, bir ilaç-tarama yönteminin geliştirilmesi gereklidir ve RA şartlarını yansıtacak bir hücre malzeme gereklidir.
Fibroblast benzeri sinoviyosit (FLSs) RA 9,10 patogenezinde aktif bir hücresel katılımcı vardır. FLSs de sinovyumdaki olarak adlandırılır eklem kapsülü ve oyuk arasındaki eklem iç yüzeyi bulunmaktadır. eklem yapısını destekleyen ve çevreleyen kıkırdak besinleri sağlayarak, FLSs genellikle eklem fonksiyon ve bakım önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, RA'da FLSs invaziv bir fenotip var. RA FLSs sonunda sonsuz çoğalması 10 çevreleyen kemik yok, bir kanser gibi fenotip vardır. Bu eşsiz özelliği ile FLSs RA patobiyolojisi yansıtabilir umut verici bir madde olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler nadiren üretilir, ve hücreler, in vitro çok geçitler geçmesi gibi hücre fenotipleri değiştirebilir </em> durumlar. Nedenle, hastanın durumunu temsil edebilecek bir araç olarak RA FLSs kullanmak için karmaşık olabilir.
Teorik olarak, RA hasta kaynaklı iPSCs (RA-iPSCs) ilaç tarama ve ileri araştırmalar için ideal bir araç haline gelebilir. Oluşturulan iPSCs kendini yenileme yeteneğine sahip ve tutulan ve in vitro genişletilebilir. Pluripotensin, bu hücreler, RA ve diğer kemik ile ilgili hastalıklar 11 özel araştırma için hücre materyalini katkıda olgun kondrosit ve osteosit soy, ayırt edilebilir.
Bu çalışmada, biz izole etmek ve Yamanaka faktörleri içeren lentiviruses kullanarak FLSs RA-iPSCs oluşturmak için bir ameliyatla çıkarıldı sinovyum ve nasıl dan FLSs genişletmek için nasıl gösterilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSCs keşfinden önce, bilim adamları başta farklılaşma ile kök hücre biyolojisi ve diğer hücre soyları incelemek için EKH kullanılır. Ancak, EKH bir erken evre embriyo bir blastosist, iç kitle kaynaklanır. EKH izole etmek için, blastosist tahrip üstesinden gelinemez etik sorunlar yükselterek, kaçınılmazdır. EKH stemness özellikleri ve pluripotensini olsa Ayrıca, bu bireylerden elde edilemez ve bazen de kişisel analizleri ve hastalık taranması için ideal bir araç bulunmaktadır.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
