Generering av indusert-pluripotente stamceller ved hjelp av fibroblast synoviocytter Isolert fra ledd av pasienter med revmatoid artritt

Summary

Her beskriver vi en protokoll for generering av menneskeskapte-pluripotente stamceller fra pasient-avledet fibroblast-synoviocytter, ved hjelp av et system uten lentiviral feeder-celler.

Abstract

Eldre somatiske celler kan reverseres i en pluripotent stamcellelignende tilstand ved hjelp av et definert sett med omprogrammering faktorer. Tallrike studier har generert indusert-Pluripotent stamceller (iPSCs) fra ulike somatiske celletyper ved transducing fire Yamanaka transkripsjonsfaktorer: OCT4, Sox2, Klf4 og c-myc. Studiet av iPSCs forblir i forkant av biologisk og klinisk forskning. Spesielt kan pasientspesifikke iPSCs brukes som en banebrytende verktøy for studier av sykdommen patobiologi, ettersom iPSCs kan induseres fra vev av en hvilken som helst individ. Revmatoid artritt (RA) er en kronisk betennelsessykdom, klassifisert av ødeleggelse av brusk og bein strukturen i leddet. Synovial hyperplasi er en av de viktigste grunnene eller symptomer som fører til disse resultater i RA. Fibroblast-synoviocytter (FLSs) er de viktigste komponentcellene i hyperplastiske synovium. FLSs i felles limitlessly spre seg, til slutt invadere nabo cartilalder og bein. For tiden kan det hyperplastisk synovium fjernes ved et kirurgisk inngrep. Det fjernede synovium brukes for RA forskning som et materiale som reflekterer den inflammatoriske tilstand av skjøten. Som en stor aktør i patogenesen av RA kan FLSs brukes som materiale for å generere og undersøke iPSCs av RA-pasienter. I denne studien brukte vi FLSs av en RA pasient å generere iPSCs. Ved hjelp av en lentiviral system, oppdaget vi at FLSs kan generere RA pasient-spesifikke IPSC. De iPSCs generert fra FLSs kan videre brukes som et verktøy for å studere patofysiologien av RA i fremtiden.

Introduction

Pluripotente stamceller er neste-generasjons plattform i ulike kliniske og biologiske felt. De er et lovende verktøy som kan brukes på sykdom modellering, legemiddelscreening, og regenererende medisinsk terapi. Humane embryonale stamceller (hESCs) ble i hovedsak brukt til å studere og forstå pluripotente celler. Imidlertid isolert ved ødeleggelse av det humane blastocyst, er hESCs forbundet med flere etiske problemer. I 2007, Dr. Shinya Yamanaka og hans team reversert cellen programmeringsprosessen og utviklet stamceller fra menneskelige voksne somatiske celler ^1,2. Derfor, i motsetning til hESCs, indusert-Pluripotent stamceller (iPSCs) kan genereres fra modne somatiske celler, unngår de etiske hindrene.

Vanligvis er iPSCs generert av levering av fire eksogene gener: Oct4, Sox2, Klf4, og c-Myc. Disse Yamanaka faktorene er opprinnelig levert med lentiviral og retrovirale systemer. De første iPSCs ble avledet fra mus somatisk calen ^3. Deretter ble teknikk anvendt på humane dermale fibroblaster ^1,2. Senere studier med hell generert iPSCs fra forskjellige kilder, for eksempel urin ^4, blod ^5,6, keratinocytter ^7, og en rekke andre celletyper. Det er imidlertid noen somatiske celler som ikke har vært brukt i omprogrammering, og screening av de reprogrammerings-egenskapene til forskjellige celletyper fra bestemte vev i sykdomstilstand, er fremdeles nødvendig.

Revmatoid artritt (RA) er en sykdom som kan slå alle skjøter og føre til autoimmune tilstander i andre organer. RA rammer ca 1% av voksne i den industrialiserte verden. Det er en ganske vanlig sykdom og forekomsten øker hvert år ^åtte. Imidlertid er RA vanskelig å identifisere i de tidlige stadier og oncebone ødeleggelse oppstår det ingen behandling som kan gjenopprette skadene. Videre legemidlets effekt er forskjellig fra pasient til pasient, og det er vanskelig å forutsi den legeine som er nødvendig. Derfor er utvikling av et medikament-screening-metoden er nødvendig, og et cellemateriale som kan gjenspeile betingelsene for RA er nødvendig.

Fibroblast-synoviocytter (FLSs) er en aktiv cellulær deltaker i patogenesen av RA ^9,10. FLSs finnes i ledd intimale foring mellom leddkapselen og hulrom, som også er referert til som synovium. Ved å støtte den felles struktur og gi næring til den omgivende brusk, FLSs vanligvis spille en avgjørende rolle i leddfunksjon og vedlikehold. Men FLSs i RA har en invasiv fenotype. RA FLSs har en kreftlignende fenotype, slutt å ødelegge omkringliggende benet ved uendelig spredning ^10. Med denne unike egenskap, kan FLSs brukes som et lovende materiale som kan gjenspeile den patobiologi av RA. Likevel er disse cellene sjelden produsert, og cellen fenotyper endre som cellene går gjennom flere passasjer i in vitro </em> forhold. Derfor kan det være komplisert å bruke RA FLSs som et verktøy som kan representere pasientens tilstand.

Teoretisk kan RA pasient avledet iPSCs (RA-iPSCs) blitt et ideelt verktøy for narkotika screening og videre forskning. Generert iPSCs har selvfornyelse evne og kan opprettholdes og utvides in vitro. Med pluripotency, kan disse cellene differensieres til modne chondrocyttransplantasjon og osteocyte slektsnavn, som kan bidra cellemateriale for spesifikk forskning i RA og andre bein-relaterte sykdommer ^11.

I denne studien viser vi hvordan du isolerer og utvide FLSs fra et kirurgisk fjernet synovialhinne, og hvordan å generere RA-iPSCs fra FLSs hjelp lentiviruses inneholder Yamanaka faktorer.

Protocol

Etikk Uttalelse: Denne studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of The Catholic University of Korea (KC12TISI0861). 1. Synoviocyte Isolering og Utvidelse Synoviocyte Isolation Steriliser to par kirurgiske sakser og en pinsett. Overfør synovial vev til en 100 mm skål og vask med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1% penicillin / streptomycin. Skjær av gulaktig fettvev og beinrester. Overfør den trimmede vevet til en brønn i en 6-brønns…

Representative Results

I denne studien, beskriver vi en protokoll for å generere iPSCs fra FLSs ved hjelp av et lentiviral system. Figur 1A viser en enkel løsning av FLS isolasjonsprotokoll. Etter kirurgisk fjerning av synovium ble vevet kuttet opp i små stykker ved hjelp av kirurgiske sakser. Kollagenase ble tilsatt for å isolere cellene fra klumper av vev. Celler ble inkubert i 14 dager før videre behandling. Figur 1B viser morfologien av den isolerte F…

Discussion

Før oppdagelsen av iPSCs, forskere hovedsakelig brukt ESCs å studere stamcellebiologi og andre celle linjer gjennom differensiering. Imidlertid ESCs stammer fra den indre massen av en blastocyst som er tidlig stadium embryo. For å isolere ESCs, ødeleggelse av blastocyst er uunngåelig, heve etiske problemstillinger som er umulig å overvinne. Dessuten, selv ESCs har stemness egenskaper og pluripotency, de kan ikke hentes fra enkeltpersoner, og er noen ganger ikke et ideelt verktøy for personlig analyse og sykdom sc…

Materials

100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/mL)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004