גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון
Summary
This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Abstract
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Introduction
בפגיעות עצבים, גדמי הפרוקסימלי ועצב דיסטלי מנועים לעתים קרובות מן ההתכנסות ישירה של fascicles עצב בשל באתר הנגע 1-2. בדרך כלל, קטעי האקסון מורכבים הורה מאוד ומיושר צרורות של אקסונים, המהווים רשתות מורכבות של קישוריות. עם זאת, התחדשות של עצבים היא תהליך כאוטי עקב יישור האקסון מאורגן היטב 3-4. לכן, כדי ליצור כמות מספקת של התחדשות אקסונים כי לגשר על אתר הנגע, יש צורך להשרות יישור אקסונלית מאורגן היטב. בנוסף, פגיעה במיאלין מלווה פציעות עצב בשל מות התאים myelinating במקום הפציעה. מאז demyelination מאוד פוגע קיבולת המוליך לשרוד אקסונים, טיפולי מיקוד demyelination או קידום מיאלין מחדש הם משמעותיים עבור התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית 5. לכן המטרה של פרוטוקול זה היא להמחיש גישה הנדסית מטפלת בשני נושאים אלושל התחדשות של עצבים.
אנאיזוטרופיה Surface, אשר מוגדרת כהבדל, כאשר נמדדו לאורך צירים שונים, בתוך התכונות הפיסיקליות או מכאניות של חומר, יושמה להשפיע יישור תא, צמיחה, והגירת 6-7. בנוסף טופוגרפיה, ישנן שיטות אחרות כדי לגרום אנאיזוטרופיה. בעבר, חקרנו אנאיזוטרופיה משטח המושרה על ידי מראש מתיחה סטטית מכני של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) קרום. התאוריה של "סופר עיוות קטן המוטל על גדול" חזתה כי הנוקשות היעילות התאים לחוש בכיוון נמתח נבדלו בכיוון ניצב, וההבדל הזה נוקשות יעילות הוא בשל שטח אנאיזוטרופיה 8. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) בתרבית על קרום מראש נמתח PDMS מסוגלים לחוש את אנאיזוטרופיה ידי משיכת משטח פעיל וכתוצאה מכך, ליישר בכיוון מראש נמתח 9. באופן דומה, ar משטח איזוטרופיאייסינג ממשטח מראש נמתח מכני משפיע על יישור, כמו גם צמיחה myelination של גנגליון השורש הגבי (DRG) אקסונים 10. כאן אנו מספקים פרוטוקול גרימת אנאיזוטרופיה השטח על מצע PDMS מראש נמתח סטטי כדי לשפר התחדשות האקסון 10.
כדי לעורר יישור האקסון, תכונות טופולוגי עם דפוסים רצויים, דיווח על מנת לספק הדרכת קשר באמצעות סיבים מיושרים וערוצים 6,11-12, הודגמו כדי להקל יישור האקסון 11,13. עם זאת, דיווח טכניקות גרימת יישור האקסון באמצעות תכונות טופולוגי, כגון סיבים, ערוצי דפוסים, לא הצליח להאריך ולהגדיל את העובי של אקסונים. לעומת זאת, הדרגתי מכאני מתיחה הוביל יישור האקסון לכיוון המתיח עם אקסונים ארוך ועבה כי גדל עם הגודל של המתיחה 14. עם זאת, כולל התקן מנוע מופעל vivo אינואפשרי. לעומת זאת, אנאיזוטרופיה סטטי מושרה מראש נמתחת היא פחות מסובכת ויכולה להיות משולבת יותר בקלות לתוך עיצובי פיגום בעתיד ליישומי in vivo.
בפרוטוקול זה, מערכת תרבית תאים טרום נמתח סטטי משמש לגרום אנאיזוטרופיה משטח ללא תכונות טופולוגי. מערכת ההתרבות נמתח מראש מורכב קרום PDMS, מסגרת stretchable ובמה מתיחה, ואז הממברנה מקובע המסגרת בסדר גודל למתוח מראש מוחל על הבמה המתיחה. טרי מבודד נוירונים DRG מתורבת על פני השטח טרום נמתח עד 21 ימים מנוטרים ליישור ועובי האקסון. כתוצאה מכך, תאי שוואן (SCS) שיתוף תרבותי עם אקסונים המיושרים מנוטרים עבור מעטפת המיאלין. על ידי שילוב אנאיזוטרופיה משטח המושרה מראש למתוח הצלחנו לשפר התא יישור-בידול האקסון יישור-צמיחה של MSCs ונוירונים DRG 9-10, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לגרום יישור האקסון על משטח מראש נמתח, ישנם שני שלבים קריטיים: 1) קרום PDMS חייב להיות שטוח של עובי אחיד; ו -2) ותאי גלייה חייב יוסר DRG. לאחר ערבוב PDMS ו crosslinker וריפוי בתנור, הג'ל PDMS crosslinked צריך להישמר על גבי ספסל שטוח מטופל בזהירות כדי למנוע הטיה. טיפול פלזמת החמצן של קרום …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות אריק ואסקו עזרתו בהכנת מצעים PDMS, ד"ר Shiyong וואנג במעבדה של ד"ר מרינה מאטה באוניברסיטת מישיגן עבור הצעות מועילות והכשרה של בידוד DRG, וד"ר מארק Tuszynski וד"ר . וו מארי קמפנה באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו לקבלת הצעות פרוטוקול מועיל עבור בידוד SC. מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0,941,055 ו CBET 1,510,895), המכון הלאומי לבריאות (R21CA176854, R01GM089866, ו R01EB014986).
Materials
| Polydimethylsiloxane （PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
| 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
| FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
| Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
| Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
| then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. . Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. . Organosilicon Materials. , (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
