Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle ^1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung ^3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzungen durch Tod der myelinisierende Zellen an der Verletzungsstelle. Da Demyelinisierung stark beeinträchtigt die leitende Kapazität Axone zu überleben, Behandlungen Targeting Demyelinisierung oder Remyelinisierung fördern sind bedeutsam für die funktionelle Erholung nach einer Nervenverletzung ^5. So ist das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Engineering-Ansatz zu verdeutlichen, die diese beiden Fragen behandeltder Nervenregeneration.

Oberflächenanisotropie, die als Differenz definiert, wenn sie entlang verschiedenen Achsen gemessen, in einem Material der physikalischen oder mechanischen Eigenschaften, wurde angewendet Zellausrichtung zu beeinflussen, das Wachstum und die Migration ^6-7. Neben Topographie, gibt es andere Methoden Anisotropie zu induzieren. Bisher untersuchten wir Oberflächenanisotropie durch mechanische statische Vorstreckung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Membran induziert. Die Theorie der "kleinen super Verformung auf großen auferlegt" vorausgesagt , daß die effektive Steifigkeit der Zellen in der gedehnten Richtung erfassen von der senkrechten Richtung abweicht, und diese Differenz der effektiven Steifigkeit aufgrund Anisotropie ⁸ an die Oberfläche. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) , kultiviert auf einem vorgedehnten PDMS – Membran können die Anisotropie zu erfassen , indem aktiv die Oberfläche gezogen und als Ergebnis, richten in der vorgedehnten Richtung ^9. In ähnlicher Weise eine anisotrope Oberflächen arising von einer mechanischen Oberflächenvorgedehnten wirkt sich auf die Ausrichtung, ¹⁰ Axone sowie das Wachstum und die Myelinisierung von dorsal root ganglion (DRG). Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion Oberflächenanisotropie auf einer statischen vorgedehnten PDMS Substrat ¹⁰ Axonregeneration zu verbessern.

Zu axon Ausrichtung, topologische Merkmale mit gewünschten Mustern hervorzurufen, berichtet Kontaktführung durch die ausgerichteten Fasern zu schaffen und Kanäle ^6,11-12 wurden nachgewiesen axon Ausrichtung ^11,13 erleichtern. Jedoch zum Induzieren axon Ausrichtung durch topologische Merkmale Techniken berichtet, wie Fasern, Kanäle und Strukturieren, waren nicht imstande, zu verlängern und um die Dicke der Axone erhöhen. Im Gegensatz dazu Reckung mechanischen graduellen zu axon Ausrichtung in Dehnungsrichtung geführt mit längeren und dickeren Axone , die mit der Größe der Dehnung ¹⁴ erhöht. Jedoch ist eine angetriebene Motor Vorrichtung in vivo nicht enthältmöglich. Im Gegensatz dazu ist statisch vorgedehnten induzierte Anisotropie weniger kompliziert und leichter in Zukunft Gerüst Entwürfe für in vivo – Anwendungen integriert werden können.

In diesem Protokoll wird eine statische vorgedehnten Zellkultursystem wird verwendet Oberflächenanisotropie ohne topologische Eigenschaften zu induzieren. Die vorgedehnten Kultursystem besteht aus einem PDMS-Membran zusammengesetzt ist, einem dehnbaren Rahmen und einer Streckstufe, wobei die Membran an dem Rahmen befestigt ist und eine vorbestimmte Strecke Größe auf der Streckstufe zugeführt wird. Frisch isolierte DRG auf der vorgedehnten Oberfläche kultivierten Neuronen für bis zu 21 Tage für axon Ausrichtung und Dicke überwacht. Anschließend Schwann-Zellen (SCs) co-kultiviert mit den ausgerichteten Axone werden Myelinisierung überwacht. Vorstreckung induzierte Oberflächenanisotropie Durch die Integration konnten wir Ausrichtung der Zellen-Differenzierung und Axon Ausrichtung Wachstum von MSCs und DRG – Neuronen ^9-10 bzw. zu verbessern.

Protocol

Alle Verfahren zur Isolierung der Zellen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Michigan State University genehmigt. 1. Herstellung von vorgespannter anisotroper Oberfläche Mischen Sie eine 10: 1-Lösung von Base und Härter und gießen Sie die Mischung in eine Gewebekulturschale (12 cm Durchmesser). Verwenden Sie 4.900 mg Base und 490 mg Mittel für die gesamte Vernetzungs Mischung härtet. Halten Sie die Gelmischung unter Vakuum für 20 min Luftblasen zu entfern…

Representative Results

Die vorgedehnten Zellkultursystem DRG axon Ausrichtung gefördert 10. DRG-Neuronen wurden auf vorgestreckten und ungereckten Oberflächen für 12 Tage. Die Axone wurden für β-III-Tubulin gefärbt ihre Ausrichtung zu zeigen. 2 vergleicht axon Ausrichtung auf den vorgestreckten und ungestreckte PDMS Substrate nach 12 Tagen Kultur. Die DRG Axone parallel zur Streckrichtung ausgerichtet sind, während sie zufällige Ausrichtung zeigte und bildeten ein miteinande…

Discussion

Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die…

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.