後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ
Summary
This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Abstract
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Introduction
神経損傷では、近位および遠位の神経断端はしばしば病変部位1-2に神経繊維束の直接の再編が防止されます。通常、軸索路は、接続の複雑なネットワークを形成する軸索の高度に秩序と整列束で構成されています。しかし、神経再生は不十分編成軸索整列3-4による無秩序なプロセスです。したがって、損傷部位を埋める軸索再生の十分な数を生成するためには、よく組織軸索整列を誘導することが必要です。さらに、脱髄は、損傷部位でのミエリン形成細胞の死による神経損傷を伴います。脱髄が強く軸索の生存導電容量を損なうので、脱髄をターゲットまたは再ミエリン化を促進する治療は、神経損傷5後の機能回復のために重要です。したがって、このプロトコルの目的は、これらの2つの問題に対処する工学的手法を説明することです神経再生の。
材料の物理的又は機械的性質に、異なる軸に沿って測定したとき、差として定義される面の異方性は、セルの配置、増殖、および遊走6-7に影響を与えるために適用されています。地形に加えて、異方性を誘導する他の方法があります。以前、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）膜の機械的静的プレストレッチによって誘発される表面異方性を調べました。 「小変形超大規模に課さ」の理論は、細胞が延伸方向に感知有効剛性は、垂直方向と異なり、有効剛性の違いは、表面異方性8によるものであること。予想しました予備延伸PDMS膜上で培養した間葉系幹細胞（MSC）は、積極的に表面を引っ張ることにより、結果として異方性を感知する事前延伸方向9に整列することができます。同様に、異方性表面AR機械的な事前延伸表面からイジングすると、アライメントに影響を与えるだけでなく、後根神経節（DRG）の成長と髄鞘形成は、10を軸索。ここでは、軸索再生10を強化するために、静的な事前延伸PDMS基板上の表面異方性を誘導するためのプロトコルを提供します。
軸索アライメント、目的のパターンを持つ地形的特徴を引き出すために、整列した繊維およびチャネル6,11-12を通じて接触ガイダンスを提供することが報告、軸索アライメント11,13を容易にするために実証されました。しかしながら、そのような繊維、チャネルおよびパターニングなどの地形的特徴を介して軸索整列を誘導するための技術が報告され、長く及び軸索の厚さを増加させることができませんでした。これとは対照的に、ストレッチング緩やかな機械的ストレッチ14の大きさに伴って増加長く、太く軸索との延伸方向における軸索アライメントにつながりました。しかしながら、 インビボでの電力供給のモータ装置を搭載することはありません実現可能。対照的に、静的な事前延伸誘導異方性は、より複雑で、より容易にインビボ用途のための将来の足場の設計に組み込むことができます。
このプロトコルでは、静的な事前延伸細胞培養系は、トポロジー特徴なし表面異方性を誘導するために使用されます。膜は、フレームに固定され、所定の伸びの大きさは、延伸ステージに適用されるところの事前延伸培養系は、PDMS膜、伸縮フレーム延伸ステージで構成されています。最大21日間の事前延伸表面上で培養新たに単離したDRGニューロンは軸索のアライメントおよび厚さのために監視されています。続いて、シュワン細胞（SCS）整列軸索と共培養は、髄鞘形成のために監視されます。プレストレッチ誘発される表面異方性を組み込むことによって、私たちはそれぞれ、MSCおよびDRGニューロン9-10のセルアライメント分化と軸索配向成長を促進することができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
前延伸表面に軸索アライメントを誘導するために、2つの重要なステップがあります：1）PDMS膜は、均一な厚さのフラットでなければなりません。及び2）グリア細胞をDRGから削除する必要があります。 PDMSと架橋剤を混合し、オーブンで硬化させた後、架橋PDMSゲルは平らな作業台の上に保持し、任意の傾きを避けるために慎重に取り扱われるべきです。プラズマ処理後（細胞接着に必要な）表…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、PDMS基板の製造に彼の援助のためのエリック・バスコ、博士Shiyong王有益な提案とDRG分離の訓練のためのミシガン大学の博士マリーナ・マタの研究室で、博士マークTuszynski博士に感謝したいと思いますUCサンディエゴ校。W.マリーカンパーナ有益な提案とSC分離のためのプロトコルのために。この研究は、国立科学財団（CBET 0941055とCBET 1510895）、国立衛生研究所（R21CA176854、R01GM089866、およびR01EB014986）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Polydimethylsiloxane （PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
| 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
| FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
| Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
| Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
| then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
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