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Medicine

CaspaseTracker के द्वारा Vivo में Anastasis का पता लगाना

Published: February 01, 2018
doi:
10.3791/54107
, ,
1Institute for Basic Biomedical Sciences,Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences,Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis को वीवो में डिटेक्ट करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया को उलट देने वाली कोशिकाओं को सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं से आकृति किया जा सकता है । यहाँ हम का पता लगाने और उन कोशिकाओं है कि लाइव जानवरों में anastasis से गुजरना पर नज़र रखने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन हमारे नव विकसित vivo में CaspaseTrackerीय प्रणाली.

Abstract

Anastasis (“जीवन के लिए बढ़ती” के लिए ग्रीक) एक हाल ही में खोज सेल वसूली घटना जिससे मर कोशिकाओं देर हो सकती है चरण कोशिका मृत्यु प्रक्रियाओं है कि आम तौर पर माना जाता है आंतरिक रूप से अपरिवर्तनीय है । anastasis को बढ़ावा देने के सिद्धांत बचाव में सकता है या घायल कोशिकाओं है कि ऐसे cardiomyocytes या न्यूरॉन्स के रूप में प्रतिस्थापित करने के लिए मुश्किल हैं संरक्षित, जिससे ऊतक वसूली की सुविधा. इसके विपरीत, कैंसर की कोशिकाओं में anastasis को दबाने, विरोधी कैंसर के उपचार के बाद apoptosis के दौर से गुजर, कैंसर कोशिका मृत्यु सुनिश्चित करने और पुनरावृत्ति की संभावना को कम कर सकते हैं । हालांकि, इन अध्ययनों से जीवित पशुओं में anastasis से गुजरना कोशिकाओं के भाग्य पर नज़र रखने के लिए उपकरणों की कमी से बाधा गया है । चुनौती कोशिकाओं है कि वसूली के बाद उनके आकृति सामांय उपस्थिति के बावजूद सेल मौत की प्रक्रिया उलट है की पहचान है । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, हमने Drosophila और स्तनधारी CaspaseTracker का विकास किया है जो इन विट्रो या vivoमें anastatic कोशिकाओं को पहचान और स्थाई रूप से ट्रैक कर सकते हैं । यहां, हम इस पीढ़ी और CaspaseTracker दोहरी प्रणाली का उपयोग करने के लिए vivo प्रोटोकॉल में मौजूद का पता लगाने और सेल मौत उत्तेजनाओं के लिए क्षणिक जोखिम के बाद Drosophila melanogaster में anastasis ट्रैक । जबकि पारंपरिक उपसेंसरों और प्रोटोकॉल कोशिकाओं को सक्रिय रूप से अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर लेबल कर सकते हैं, CaspaseTracker को स्थाई रूप से कोशिकाओं है कि caspase सक्रियण के बाद बरामद किया है लेबल कर सकते है-देर चरण apoptosis की एक बानगी, और इसके साथ ही सक्रिय अपोप्तोटिक प्रक्रियाओं की पहचान । यह भी कोशिकाओं है कि कोशिका मृत्यु के अंय रूपों का प्रयास किया है कि प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से caspase गतिविधि शामिल की वसूली को ट्रैक कर सकते है सेंसर । इसलिए, इस प्रोटोकॉल हमें लगातार इन कोशिकाओं और उनकी संतान के भाग्य को ट्रैक करने के लिए सक्षम बनाता है, जैविक कार्यों के भविष्य के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने, आणविक तंत्र, शारीरिक और रोग के परिणाम, और उपचारात्मक निहितार्थ anastasis । हम भी उन है कि vivo मेंगैर अपोप्तोटिक caspase गतिविधि प्रदर्शन से anastasis से गुजरना कोशिकाओं को भेद करने के लिए उचित नियंत्रण पर चर्चा ।

Introduction

क्रमादेशित कोशिका मृत्यु, जैसे apoptosis, कोशिकीय जीवों में अवांछित, घायल, या खतरनाक कोशिकाओं को नष्ट करने के द्वारा भ्रूण विकास और सामान्य homeostasis में एक आवश्यक भूमिका निभाता है,2,3. कोशिका मृत्यु और अस्तित्व के बीच संतुलन की हानि कैंसर, हृदय विफलता, प्रतिरक्षा, और अध4,5,6,7,8के रूप में घातक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जल्लाद caspases के सक्रियकरण परंपरागत रूप से apoptosis9,10,11में कोई वापसी की “बिंदु के रूप में माना गया है, के रूप में यह तेजी से चलाता है और बड़े पैमाने पर सेलुलर विध्वंस12, 13,14,15,16. इस सामांय हठधर्मिता को चुनौती देते हुए, हम प्रदर्शन किया है कि संस्कृति मर प्राथमिक कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं न केवल caspase सक्रियण के बाद ठीक कर सकते हैं, लेकिन यह भी प्लाज्मा झिल्ली blebbing, सेल सिकुड़ना सहित महत्वपूर्ण कोशिका मौत की पहचान के बाद, mitochondrial विखंडन, cytosol, परमाणु और क्रोमेटिन में mitochondrial cytochrome सी की रिहाई, डीएनए क्षति, परमाणु विखंडन, phosphatidylserine के सेल की सतह जोखिम (पी एस), और अपोप्तोटिक निकायों के गठन 17 , 18 , 19 , 20 , 21. हम प्रस्ताव है कि anastasis एक आंतरिक कोशिका वसूली घटना है, के रूप में मरने कोशिकाओं सेल मौत उत्तेजनाओं17,18,19,20के हटाने के बाद ठीक हो सकता है, 21. हम शब्द “Anastasis” (Αναστάσης)18गढ़ा, जिसका अर्थ है “जीवन के लिए” ग्रीक में बढ़ती है, इस अप्रत्याशित कोशिका वसूली घटना का वर्णन । anastasis के हमारे प्रेक्षण आगे हाल ही में स्वतंत्र अध्ययनों से भी पता चलता है कि phosphatidylserine externalization22,23,24, सीमित mitochondrial बाहरी के बाद कोशिकाओं की वसूली का समर्थन किया है झिल्ली permeabilization25, मिश्रित वंश कळेनासे के सक्रियकरण की तरह (MLKL), और सेल सिकुड़ते26।

निस्र्पक anastasis विनियमन तंत्र है प्रतिमान-स्थानांतरण शारीरिक, रोग, और चिकित्सीय निहितार्थ होगा । Anastasis एक पहले से अज्ञात cytoprotective तंत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए बचाव या महत्वपूर्ण postmitotic कोशिकाओं और ऊतकों है कि जगह मुश्किल कर रहे है की रक्षा कर सकते हैं, और संभवतः दिल की विफलता उत्क्रमण के लिए खाता छोड़ वेंट्रिकुलर के साथ वेंट्रिकुलर अनलोड द्वारा असिस्ट उपकरणों (LVADs)27,28, अत्यधिक प्रकाश29,30,31, या मस्तिष्क की चोट के बाद न्यूरॉन्स की मरंमत के क्षणिक जोखिम के बाद photoreceptor कोशिकाओं की वसूली३२। यदि ऐसा है तो anastasis को बढ़ावा देने के सेल और ऊतक वसूली में वृद्धि सकता है । इसके विपरीत, anastasis एक अप्रत्याशित बच कैंसर कोशिकाओं द्वारा इस्तेमाल के लिए सेल-मौत उत्प्रेरण थेरेपी जीवित रणनीति, कैंसर पुनरावृत्ति17,18के कारण हो सकता है । इसलिए, कैंसर की कोशिकाओं के दौरान और कैंसर के इलाज के बाद मरने में anastasis दबा एक उपंयास चिकित्सकीय उनके पतन को रोकने के द्वारा कैंसर का इलाज रणनीति हो सकती है ।

anastasis की प्रक्रिया के दौरान, हमने पाया है कि कुछ बरामद कोशिकाओं स्थाई आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त कर लिया और oncogenic परिवर्तन, डीएनए apoptosis के दौरान किए गए नुकसान के कारण की संभावना18,20,21 . डीएनए की मौत की प्रक्रिया के पीछे-क्षतिग्रस्त कोशिकाओं tumorigenesis की एक प्रणाली हो सकता है, संभावित निरीक्षण है कि दोहराया ऊतक चोट ऊतकों की एक किस्म में कैंसर का खतरा बढ़ जाता है अंतर्निहित घेघा में जीर्ण थर्मल चोट के रूप में, बहुत गर्म पेय पदार्थ के उपभोग के द्वारा३३,३४,३५, जिगर३६,३७, genotoxic कैंसर थेरेपी३८के बाद ट्यूमर विकास की वजह से नुकसान, ३९,४०, और सामांय ऊतकों कि विरोधी कैंसर थेरेपी४१,४२,४३,४४ के चक्र के बीच अंतराल के दौरान पैदा से नए कैंसर का विकास . यदि सच है, लक्ष्यीकरण anastasis को रोकने या कैंसर के विकास और प्रगति की गिरफ्तारी सकता है । हमने पाया है कि भुखमरी प्रेरित मर रोगाणु कोशिकाओं को पुनः में anastasis से गुजरना Drosophila19खिलाया ।  यदि anastasis डीएनए क्षति के साथ रोगाणु कोशिकाओं में होता है, यह अवलोकन है कि लंबे समय तक पर्यावरण तनाव आनुवंशिक रोगों के विकास को बढ़ावा देने के लिए खाता हो सकता है । उदाहरण के लिए, अकाल transgenerational वारिस रोगों जैसे मधुमेह और कोरोनरी हृदय रोगों४५के विकास में योगदान करते हैं । इसलिए, anastasis को समझना इस संभावित तंत्र के कारण इनहेरिट करने योग्य बीमारियों के विकास की रोकथाम के लिए रणनीतियों के लिए नेतृत्व कर सकता है ।

anastasis की खोज का दोहन और अभिनव चिकित्सा विकसित करने के लिए निर्देशित करने के लिए, यह जीवित पशुओं में anastasis के कारण और परिणाम का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, यह तकनीकी रूप से vivo मेंanastatic कोशिकाओं की पहचान करने और ट्रैक करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया से बरामद कोशिकाओं को सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं से आकृति प्रकट होता है, और वहाँ anastasis का कोई निशान नहीं है अभी तक17,18,21की पहचान की । इन समस्याओं को हल करने के लिए, हम हाल ही में एक नया विकसित vivo caspase में नामित “CaspaseTracker”19, पहचान करने के लिए और कोशिकाओं है कि जीवित रहने के बाद apoptosis को ट्रैक caspase सक्रियकरण19,४६, apoptosis10,14की बानगी । यह “भू-समय” से अलग caspase जैसे गोबर12,४७, Apoliner४८, CA-GFP४९, ApoAlert18,५०, C3AIs५१ और iCasper५२ caspase गतिविधि पर जा रहा है कि का पता लगाने, CaspaseTracker के साथ ही स्थिर रूप से भी क्षणिक गतिविधि एक्सप्रेस कि कोशिकाओं को स्थायी रूप से लेबल करने की क्षमता सुविधाएँ. इसलिए, CaspaseTracker, vivo मेंcaspase-मध्यस्थ कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के उत्क्रमण के बाद anastasis की दीर्घकालिक ट्रैकिंग सक्षम बनाता है ।

Protocol

1) CaspaseTracker की तैयारी Anesthetize2के साथ मक्खियों, और एक तूलिका का उपयोग करने के लिए 7 से 10 caspase-संवेदनशील Gal4 (DQVD)19 कुंवारी महिलाओं और 7 से 10 जी ट्रेस५३ Gal4 रिपोर्टर युवा पुरुष मक्खियों (या इसके विपर?…

Representative Results

समय चूक लाइव सेल माइक्रोस्कोपी संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में anastasis पथ करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है20, यह पहचान करने के लिए जो कोशिकाओं पशुओं में anastasis आया है चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि बरामद कोशिका…

Discussion

CaspaseTracker दोहरी सेंसर प्रणाली एक उपंयास और अनूठा उपकरण है कि हाल ही में या चल रहे caspase गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देता है, और कोशिकाओं है कि सेल मौत की प्रक्रिया उलट है और vivo मेंcaspase गतिविधि का…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम चित्र 3 सी में और वीडियो पांडुलिपि में Drosophila छवि के लिए डैरेन Obbard धन्यवाद; जे मैरी Hardwick, वेड गिब्सन, और हीथ एम मेंने इस पांडुलिपि के बहुमूल्य चर्चा के लिए । यह काम एक सर एडवर्ड Youde मेमोरियल फेलोशिप (H.L.T.), डॉ वाल्टर Szeto मेमोरियल छात्रवृत्ति (H.L.T.), फुलब्राइट ग्रांट 007-2009 (H.L.T.), लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन फेलोशिप (H.L.T.), और NCI K22 ग्रांट CA204458 (H.L.T.) द्वारा समर्थित किया गया । हो लाम तांग जीवन विज्ञान अनुसंधान फाउंडेशन (2014-2017) के एक Shurl और Kay Curci फाउंडेशन फैलो था ।

Materials

CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).
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