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Medicine

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Published: February 01, 2018
doi:
10.3791/54107
, ,
1Institute for Basic Biomedical Sciences,Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences,Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Abstract

Anastasis (“ressurreição para a vida” em grego) é um fenômeno de recuperação celular recentemente descoberto pelo qual as células a morrer pode reverter processos de morte celular do tarde-estágio que geralmente são considerados intrinsecamente irreversível. Promoção anastasis poderia no resgate de princípio ou preservar feridos células que são difíceis de substituir tais como cardiomyocytes ou neurônios, facilitando assim a recuperação do tecido. Por outro lado, suprimindo anastasis em células de câncer, passando por apoptose após terapias contra o cancro, pode assegurar a morte de células de câncer e reduzir as chances de recorrência. No entanto, estes estudos foram dificultados pela falta de ferramentas para controlar o destino das células que passam por anastasis em animais vivos. O desafio é identificar as células que reverteram o processo de morte celular apesar de sua aparência morfologicamente normal após a recuperação. Para superar esta dificuldade, nós desenvolvemos Drosophila e sistemas de biosensor CaspaseTracker mamíferos que podem identificar e controlar permanentemente o anastatic células in vitro ou in vivo. Aqui, apresentamos os protocolos na vivo para a geração e utilização do sistema CaspaseTracker dual biosensor para detectar e rastrear anastasis em Drosophila melanogaster após exposição transitória aos estímulos de morte celular. Enquanto biosensores convencionais e protocolos podem rotular as células ativamente submetidos à morte de células apoptóticas, o biosensor CaspaseTracker permanentemente pode rotular as células que se recuperaram após a ativação de caspase – uma marca registrada da apoptose do tarde-estágio, e simultaneamente identifica processos apoptotic ativo. Este biosensor também pode acompanhar a recuperação das células que tentou outras formas de morte celular que directa ou indirectamente envolvidas caspase atividade. Portanto, este protocolo permite-nos acompanhar continuamente o destino dessas células e seus descendentes, facilitando estudos futuros da funções biológicas, mecanismos moleculares, fisiológicas e patológicas consequências e implicações terapêuticas de anastasis. Também discutimos os controles adequados para distinguir células que passam por anastasis daqueles que exibem não-apoptotic caspase atividade in vivo.

Introduction

Programado a morte celular, tais como apoptose, desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário e homeostase normal, eliminando indesejadas, feridas ou perigosas de células em organismos multicelulares1,2,3. A perda do equilíbrio entre a morte celular e sobrevivência pode levar a consequências fatais como câncer, insuficiência cardíaca, auto-imunidade e degeneração4,5,6,7,8. Ativação de carrasco caspases tem sido tradicionalmente considerada como o “ponto sem retorno” em apoptose9,10,11, que provoca rápida e maciça demolição celular12, 13,14,15,16. Desafio este dogma geral, temos demonstrado que culturas de células primárias moribundos e células cancerosas podem recuperar a não somente após a ativação de caspase, mas também seguir célula importante marcas de morte, incluindo blebbing de membrana plasmática, encolhimento celular, mitocondrial fragmentação, liberação de mitocondrial citocromo c no citosol, nuclear e condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, célula superfície exposição de fosfatidilserina (PS) e formação de corpos apoptotic 17 , 18 , 19 , 20 , 21. propomos que anastasis é um fenómeno de recuperação de célula intrínsecas, como células morrendo podem recuperar após a remoção da célula morte estímulos17,18,19,20, 21. cunhou o termo “Anastasis” (Αναστάσης)18, que significa “subir de vida” em grego, para descrever este fenômeno de recuperação celular inesperado. Nossa observação de anastasis mais é suportada por recentes estudos independentes que também revelam a recuperação das células após a fosfatidilserina exteriorização22,23,24, limitado mitocondrial externa membrana de permeabilização25, ativação de linhagem mista como quinase (MLKL) e de encolhimento de célula26.

Caracterizar os mecanismos de regulação anastasis terá implicações fisiológicas, patológicas e terapêuticas mudança de paradigma. Anastasis poderia representar um mecanismo previamente desconhecido tilacoides para resgatar ou preservar importantes postmitotic células e tecidos que são difíceis de substituir e possivelmente conta para reversão de insuficiência cardíaca por descarga ventricular com ventricular esquerda assistir dispositivos (LVADs)27,28, recuperação de células fotorreceptoras após exposição transitória de luz excessiva29,30,31, ou reparação de neurônios depois de lesão cerebral32. Se então promover anastasis poderia reforçar a recuperação de células e tecidos. Por outro lado, anastasis pode ser uma tática de fuga inesperada, usada por células cancerosas a sobreviver a terapia de indução de morte celular, causando câncer recorrência17,18. Portanto, suprimindo o anastasis na morte de células cancerosas durante e após o tratamento do câncer pode ser uma romance estratégia terapêutica para curar o câncer, impedindo sua recaída.

Durante o processo de anastasis, achamos que algumas células recuperadas adquiriram permanentes alterações genéticas e foi submetido a transformação oncogênica, provavelmente devido a danos no DNA incorridos durante a apoptose18,20,21 . Inverter o processo de morte de células com DNA danificado pode ser um mecanismo de tumorigênese, potencialmente subjacente a observação que repetidas lesões no tecido aumenta o risco de câncer em uma variedade de tecidos, tais como lesões térmicas crônica do esôfago induzida pelo consumo de bebidas muito quentes33,34,35, lesão hepática devido ao alcoolismo36,37, evolução do tumor após genotóxicos câncer terapia38, 39,40e desenvolvimento de novos cancros de tecidos normais que surgem durante os intervalos entre os ciclos de terapia anti-câncer41,42,,43,44 . Se true, alvejando anastasis poderia impedir ou prender o desenvolvimento de câncer e progressão. Nós achamos que induzida por inanição moribundos células germinativas sofrem anastasis na re-alimentados Drosophila19.  Se anastasis ocorre em células germinativas com danos no DNA, pode ser conta para a observação de que prolongado estresse ambiental promove o desenvolvimento de doenças genéticas. Por exemplo, fomes contribuam para o desenvolvimento de doenças hereditárias transgeracional, como diabetes e doenças coronarianas45. Portanto, anastasis de compreensão pode levar a estratégias para a prevenção de doenças hereditárias causadas por este mecanismo potencial de desenvolvimento.

Para aproveitar a descoberta de anastasis e direcioná-lo para desenvolver terapias inovadoras, é essencial estudar a causa e consequência de anastasis em animais vivos. No entanto, tecnicamente é um desafio para identificar e rastrear anastatic células na vivo, porque as células que se recuperou do processo de morte celular aparecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais, e não há nenhum biomarcador de anastasis identificados ainda17,18,21. Para resolver esses problemas, recentemente desenvolvemos um novo na vivo caspase biosensor designado “CaspaseTracker”19, para identificar e localizar as células que sobrevivem a apoptose depois de19,de ativação do caspase46, o marca registrada do apoptosis10,14. Distinguindo-a dos biosensores caspase “tempo real” como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 que detecta atividade de caspases em curso, o biosensor CaspaseTracker adicionalmente apresenta a capacidade de permanentemente rotular as células nessa atividade caspase expressa mesmo transitoriamente. Portanto, o biosensor CaspaseTracker permite rastreamento de longo prazo de anastasis após reversão de caspase-mediada pilha morte processo em vivo.

Protocol

1) preparação de moscas CaspaseTracker Biosensor Anestesiar moscas com CO2e use um pincel para transferência de 7 a 10 sensíveis à caspase Gal4 (DQVD)19 virgem fêmeas e 7 a 10 G-rastreamento53 Gal4 repórter jovem masculinas moscas (ou vice-versa) no mesmo frasco com comida de mosca e colar de fermento fresco.Nota: Cruz de moscas Gal4 Caspase-sensível (DQVD) e G-rastreamento produzirá moscas de descendência CaspaseTracker. …

Representative Results

Enquanto microscopia de lapso de tempo célula viva é um método confiável para trato anastasis em pilhas cultivadas20, é um desafio para identificar quais células sofreram anastasis em animais, porque as células recuperadas parecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais que não procuraram a morte celular. Por exemplo, células de cancro do colo do útero humano HeLa exibem características morfológicas de2,apoptose<sup class="xre…

Discussion

O sistema de dupla biosensor CaspaseTracker é uma nova e exclusiva ferramenta que permite a detecção de recente ou atividade caspase em curso e rastreamento de células que reverteram a morte celular processar e sobrevivem depois de experimentar caspase atividade na vivo. Enquanto atividade caspase tem sido tradicionalmente assume-se como uma marca registrada da apoptose, crescentes estudos revelam que não-apoptotic caspase atividade desempenha funções potenciais em funçõ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Darren Obbard imagem de Drosophila em Figura 3 e no manuscrito de vídeo; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb para discussão valiosa sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright conceder 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e o ICN K22 concedem CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang era um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de pesquisa de Ciências da vida (2014-2017).

Materials

CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).
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