Mesure de temps de survie dans<em> Brachionus</em> Rotifères: Synchronisation des conditions maternelles

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

Les rotifères sont microscopiques zooplancton cosmopolite (<1 mm) qui constituent le phylum rotifères ^1. Ils ont un plan de corps simple composé d'environ 1000 cellules somatiques, ainsi qu'un appareil de ciliaire de roue comme caractéristique appelée la couronne, qui est utilisé pour la locomotion et l'alimentation. La plupart des rotifères appartiennent à des classes Monogononta ou Bdelloidea, qui contiennent environ 1.600 et 500 espèces, respectivement ^2. Rotifères Monogonont ont généralement deux phases de la reproduction sexuée et asexuée (parthénogenèse cyclique), tandis que les rotifères bdelloides reproduisent par parthénogenèse obligatoire ^3. Il est ainsi possible d'obtenir des individus de rotifères génétiquement identiques, ce qui assure une grande reproductibilité des expériences. En outre, ils ont plusieurs autres avantages comme organismes modèles, comme une courte durée de vie, la facilité de la culture, la disponibilité des données de séquences génomiques et transcriptomiques ^4-7, et une position phylogénétique unique , distante d'unerthropods et nématodes ^8. Les rotifères sont donc prometteurs modèles d'invertébrés dans écologiques, toxicologiques et études sur le vieillissement ^9-12.

Le temps de survie en cas d' exposition au stress ou à des produits chimiques de l' environnement est un paramètre fréquemment mesurée dans ces domaines de recherche ^13-19. Toutefois, la prudence est nécessaire lors de la mesure de la durée de survie des rotifères parce qu'il est sensible aux conditions environnementales de leurs mères. A savoir, dans le monogonont Manjavacas rotifères Brachionus, progéniture femelle de mères âgées ont une durée de vie plus courte que celles des jeunes mères; Cependant, la restriction calorique maternelle (CR) compense partiellement les effets délétères de ²⁰ l' âge maternel avancé. Dans B. plicatilis, CR maternelle fournit la progéniture de la longévité, le temps de survie longtemps sous la famine, et de haute résistance au stress oxydatif associé à l' expression accrue des enzymes antioxydantes ^21,22. L'effet de l'âge maternela également été observée dans les rotifères bdelloides ^23. Par conséquent, les conditions de rotifères expérimentales doivent être soigneusement synchronisées sur plusieurs générations avant que les mesures de temps de survie.

Ici , nous fournissons un protocole pour la mesure du temps de survie en rotifères Brachionus suivant la synchronisation des conditions de culture sur plusieurs générations. Le jeûne intermittent (SI), une variation de CR où rotifères sont nourris régulièrement, a été appliquée pour révéler l'effet de la synchronisation en raison des effets bien connus du SI sur la longévité ^22,24.

Protocol

1. Préparation des milieux Remarque: Utilisez la moitié diluée Brujewicz eau de mer artificielle de la salinité de 16,5 ppt (PSU). Autres seawaters artificiels sont aussi fréquemment utilisés pour la culture Brachionus rotifères 25,26. Ajouter du NaCl 454 mM, 26 mM de MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM de KCl et 10 mM de CaCl2 à 4,5 litres d' eau distillée (volume final sera de 5 L). Vous pouvez également utiliser l'eau…

Representative Results

La figure 1 montre les courbes de survie représentatives des populations mal synchronisées (sur deux répétitions). Dans cette expérience, les rotifères étaient soit tous les jours nourris [groupe ad libitum (AL)] ou tous les autres jours (IF groupe). La médiane de survie était de 13 et de 18 jours dans l'AL et si des groupes, respectivement. Bien qu'il soit bien connu que IF prolonge la durée de vie du rotifères, cette expérience n'…

Discussion

Le protocole actuel décrit un procédé pour mesurer le temps de survie chez les rotifères Brachionus. L'étape critique est la synchronisation des conditions de rotifères sur plusieurs générations. Lorsque rotifères expérimentaux sont bien synchronisés, une courbe I de survie de type typique est observé avec très peu de mortalité précoce comme rapporté dans plusieurs études antérieures ^18,24,37,38. Les écarts-types de leur temps de survie deviennent donc plus petit par rapport à…

Materials

Sodium chloride	Wako	190-13921
Magnesium chloride	Wako	136-03995
Magnesium sulfate	Wako	131-00427
Potassium chloride	Wako	168-22111
Calcium chloride	Wako	035-00455
Sodium bicarbonate	Wako	199-05985
Sodium bromide	Wako	190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)	Millipore	HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D01	Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D07	Flat bottom
Tetraselmis, Living	Carolina Biological Supply Company	152610
PRISM 6	GraphPad Software	Version 6.0d