Mätning av levnadstid i<em> Brachionus</em> Rotifers: Synkronisering av Maternal Villkor

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

Hjuldjur är mikroskopiska kosmopolitiska djurplankton (<1 mm) som utgör stammen hjuldjur ^1. De har en enkel plan organ bestående av ca 1000 somatiska celler såväl som en karakteristisk hjuUiknande flimmerapparaten kallas koronan, som används för transport och utfodring. De flesta hjuldjur tillhör klasserna monogononta eller bdelloider, som innehåller cirka 1600 och 500 arter, respektive ^2. Monogononta hjuldjur har i allmänhet både sexuella och asexuella reproduktionsfaser (cyklisk partenogenes), medan bdelloid hjuldjur förökar sig genom obligatorisk partenogenes ^3. Det är således möjligt att erhålla genetiskt identiska hjuldjur individer, vilket säkerställer hög reproducerbarhet i experiment. Dessutom har de flera andra fördelar som modellorganismer, såsom en kort livslängd, enkel kultur, tillgång till iska och transcriptomic sekvensdata ^4-7, och en unik fylogenetisk läge på avstånd från enrthropods och nematoder ^8. Hjuldjur är därför lovande ryggradslösa modeller i ekologisk, toxikologisk och åldrande studier ^9-12.

Överlevnadstiden i exponering för stress eller kemikalier är en ofta mätt parameter i dessa forskningsområden ^13-19. Det krävs dock försiktighet vid mätning av överlevnadstiden för hjuldjur eftersom den är känslig för miljöförhållanden sina mödrar. Nämligen i monogononta rotifer Brachionus manjavacas, kvinnlig avkomma från äldre mödrar har en kortare livslängd än de från unga mödrar; Men moderns kalorirestriktion (CR) delvis kompenserar de skadliga effekterna av avancerad moderns ålder ^20. I B. plicatilis ger moderns CR avkomma livslängd, lång överlevnadstid i svält och hög oxidativ stress motstånd i samband med ökad expression av antioxidativa enzymer ^21,22. Moderns ålder effekthar också observerats i bdelloid rotatorier ^23. Därför bör villkoren för försökshjuldjur noggrant synkroniseras över flera generationer innan mätningar av överlevnadstiden.

Här ger vi ett protokoll för mätning av överlevnadstiden i Brachionus hjuldjur efter synkronisering av odlingsbetingelser under flera generationer. Intermittent fasta (IF), en variant av CR där hjuldjur matas med jämna mellanrum, applicerades för att avslöja effekten av synkronisering på grund av de välkända effekterna av IF på livslängd ^22,24.

Protocol

1. Beredning av media Obs: Använd halv-utspädd Brujewicz artificiellt havsvatten salthalt 16,5 ppt (PSU). Andra konstgjorda havsvatten används också ofta till kultur Brachionus rotiferer 25,26. Lägg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCl och 10 mM CaCla 2-4,5 L destillerat vatten (slutvolym kommer att vara 5 L). Alternativt använder avjoniserat utspädningsvatten i stället för destillerat vatten. Lägg Ca…

Representative Results

Figur 1 visar representativa överlevnadskurvorna av dåligt synkroniserade populationer (av två replikat). I detta experiment, hjuldjur var antingen utfodras varje dag [ad libitum (AL) grupp] eller varannan dag (IF grupp). Medianöverlevnaden var 13 och 18 dagar i AL och IF grupper, respektive. Även om det är välkänt att IF förlänger livslängden på hjuldjur, detta experiment misslyckades att detektera en statistiskt signifikant skillnad mellan li…

Discussion

Det nuvarande protokollet beskriver en metod för mätning av överlevnadstiden i Brachionus hjuldjur. Det kritiska steget är synkronisering av hjuldjur förhållanden under flera generationer. Om undersökningshjuldjur är väl synkroniserade, är en typisk typ I överlevnadskurva observerades med mycket lite tidig mortalitet som rapporterats i flera tidigare studier ^18,24,37,38. Standardavvikelser för deras överlevnadstiden blir därför mindre jämfört med dåligt synkroniserade hjuldjur, vilk…

Materials

Sodium chloride	Wako	190-13921
Magnesium chloride	Wako	136-03995
Magnesium sulfate	Wako	131-00427
Potassium chloride	Wako	168-22111
Calcium chloride	Wako	035-00455
Sodium bicarbonate	Wako	199-05985
Sodium bromide	Wako	190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)	Millipore	HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D01	Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D07	Flat bottom
Tetraselmis, Living	Carolina Biological Supply Company	152610
PRISM 6	GraphPad Software	Version 6.0d