Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
Altersassoziierten Erkrankungen werden immer häufiger in der modernen Gesellschaft. Da die medizinische Wissenschaft und die Lebenserwartung steigt verbessert, wächst die Bevölkerung nach Alter und die Last dieser Krankheiten wächst. Effektive Behandlungen sind notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen zu verringern, bleiben aber schwer in vielen Fällen. Nur wenn wir die Ursachen zu verstehen und Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten können die Wissenschaftler beginnen potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention. Gemeinsame altersbedingten Bedingungen umfassen neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD). PD ist die häufigste durch Neurodegeneration verursacht Bewegungsstörung beim Menschen. Die meisten Parkinson-Patienten zeigen Symptome wie Ruhetremor, Bradykinesie und Steifigkeit nach 50 Jahren. Frühem Beginn wurde auch in etwa 10% der Fälle beobachtet.
AMD ist die häufigste Ursache für Erblindung beiältere Menschen, progressiv und Photorezeptoren der retinalen Pigmentepithel (RPE) im Auge zu beschädigen. Zentrale Vision beeinträchtigt aber die periphere Sicht ist in der Regel nicht betroffen. Es gibt zwei Formen von AMD. In der "trockenen" Form, extrazelluläre Proteinablagerungen als Drusen Form zwischen dem RPE und Bruch-Membran (BM) bekannt, was zu einer geographischen Atrophie und Unschärfe des zentralen Sehens. Die schwereren "nasse" Form ergibt sich aus Neovaskularisation aus der Chorioidea über BM in die RPE und Photorezeptorschichten und kann unter der Netzhaut führen zu hamorrhaging, die zu dauerhaften Schäden an Netzhautgewebe verursacht. Genomweite Assoziationsstudien haben zuvor identifizierten Loci, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für diese Krankheit und identifiziert zwei Bereiche von Interesse verbunden sind: Komplement-Faktor H (CFH) auf dem Chromosom 1 und dem 10q26-Locus, wo die altersbedingte Makulopathie Anfälligkeit 2 (ARMS2) und Hochtemperatur – Anforderung Faktor A1 (HtrA1) Gene befinden sich 1-5 </sup>. Kombinationen dieser Allele erhöhen die Wahrscheinlichkeit von AMD in einer dosisabhängigen Weise und spezifischer SNPs können vorzugsweise entweder mit den nassen oder trockenen Formen von AMD 3-6 verbunden sein.
CFH wirkt als negativer Regulator des alternativen Wegs (AP) des Komplementsystems durch die Aktivierung von C3 zu hemmen. A single nucleotide polymorphism (SNP) wurde zu einem erhöhten Risiko von AMD verbunden, was den Austausch von Tyrosin 402 in Exon 9 mit Histidin durch eine T nach C Substitution 1. In AMD wird angenommen, dass der AP wegen einer Funktionsverlust von CFH falsch reguliert ist aber, ob das SNP spielt eine kausale Rolle ist unklar. Eine Hypothese ist , dass die positiv geladene Histidin gedacht , ist die Fähigkeit von CFH zu negieren , um interagierende Proteine C-reaktives Protein und Heparinsulfat 1,7 zu binden. In – vitro – Studien von CFH Y402H liefern widersprüchliche Ergebnisse über funktionelle Unterschiede zwischen den Varianten und in vivo Arbeit in <em> Cfh – / – Mäusen, die humanisierte CFH 8 ist noch nicht abgeschlossen. ARMS2 stromauf HtrA1 im Primatengenom befindet, wobei das Gen in Mäusen fehlt. HtrA1 ist eine Serinprotease, aber ARMS2 ist schlecht charakterisiert. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen SNPs in der AMD-assoziierten Locus hat es schwierig gemacht, die Beiträge zu Risiko einzelner Mutationen der Gene in dieser Region zu bestimmen, aber die jüngsten Arbeiten haben vorgeschlagen, dass es eine Überexpression von HtrA1 anstatt ARMS2, die Neovaskularisation führt und subretinalen Proteinablagerungen 9-11. Allerdings kann die große Nähe der Gene in diesem Locus für Interaktionen ermöglichen, der nicht zufällig eingefügt Transgene unter Verwendung untersucht werden können.
Neben AMD hat die HtrA- Familie von Serin-Proteasen wurden mit vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Alle HtrA-Proteine enthalten eine Serin-Protease-Domäne durch mindestens einen C-terminalen PDZ-Domäne folgt. HtrA1, HtrA3 und HtrA4 teilen sich die grissest Homologie, bestehend aus einem Signalpeptid, insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne, einer Kazal-Protease-Inhibitor-Domäne der Serinprotease-Domäne und eine PDZ-Domäne. HtrA2 hat eine andere N-Terminus, der aus einem Mitochondrienlokalisierungssequenz, Transmembrandomäne und Inhibitor der Apoptose – Bindungsdomäne durch die Protease und PDZ – Domänen 12-16 folgte. Mammalian HtrA1 wird durch substratinduzierte Remodeling in der aktiven Stelle der Protease – Domäne 17-20 reguliert und HtrA2 kann auch durch Wechselwirkung zwischen der Serin – Protease und PDZ – Domänen moduliert werden , die Proteaseaktivität 21 unterdrückt. Interessanterweise scheint die PDZ – Domäne nicht ähnliche Regelung zu HtrA3 16 verleihen scheinen. Die HtrA Proteasen können auch durch extrinsische Faktoren reguliert werden: Es wurde vor kurzem gezeigt , dass es eine regulatorische Interaktion zwischen HtrA1 existiert und Protoporphyrine 22 und HtrA2 können durch Phosphorylierung bei Aktivierung der p38 – MAP – Kinase reguliert werdenWeg in einem PINK1 abhängig 23. Die Löschung der einzelnen Mitglieder der Familie HtrA in Mäusen wurde dokumentiert, aber mechanistisch Effekte sind meist unklar, teilweise aufgrund des Fehlens von sichtbaren Phänotypen.
HtrA1 spielt eine wichtige Funktion bei der Proteinqualitätskontrolle und deren Fehlregulation oder Mutation hat mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Arthritis, Krebs und ein erhöhtes Risiko für AMD 3,4,24-32 in Verbindung gebracht worden. Der Verlust der HtrA2 Funktion in Nervengewebe wurde mit PD – Phänotypen in Menschen und Mäusen, während der Verlust aus nicht-neuronalen Gewebe führt zu einer beschleunigten Alterung 33-37 in Verbindung gebracht worden. HtrA3 Dysregulation hat mit Krankheiten wie Präeklampsie und bestimmte Arten von Krebs 38,39 in Verbindung gebracht worden. Hochregulierung von HtrA4 hat in den Plazenten von Präeklampsie – Patienten aber knockout Mäuse zeigen keine offensichtlichen Phänotyp 40,41 beobachtet. Der Mangel an Phänotypen in einigen knockout-Mäusen beobachtet wurde,postulierten ein Ergebnis der Kompensation zwischen dem HtrA Familienmitglied zu sein: es wird angenommen , dass sowohl HtrA4 und HtrA1 mit der TGF-B – Familie von Proteinen in Wechselwirkung treten, was eine Kompensation durch HtrA1 beim Löschen von HtrA4 41. In ähnlicher Weise wird angenommen , dass seit HtrA1 und HtrA3 ein hohes Maß an Domäne Homologien aufweisen könnten sie 42 ergänzende Funktionen haben. Aber es wurde vorgeschlagen , dass HtrA- Proteine teilweise antagonistische Rollen haben können, gemeinsame Ziele 43 zu regulieren , zu konkurrieren.
Um diese Gefahr zu untersuchen Faktoren drei humanisierten Knock-in-Mauslinien generiert wurden. In Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh und Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh, Exon 9 des Cfh Gens mit Exon 9 des menschlichen Homolog ersetzt wird. Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh codiert die nicht Krankheit assoziiert Tyrosin Rest an Position 402, während Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh die Y402H, Risiko-assoziierten SNP trägt. ImARMS2 tm1jhoh menschlichen ARMS2 Sequenz wurde an eine Region stromaufwärts von HtrA1 abgezielt. Eine loxP-flankierte STOP – Sequenz der Gensequenz , aber stromabwärts von dem Promotor enthalten UBIC wurde OzCre Mäusen durch Kreuzung exzidiert angeordnet stromaufwärts , die Cre – Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Rosa26, wie zuvor beschrieben 34. Zusätzlich zu diesen Knock-in – Linien, Knockout – Allele für Cfh und HtrA1 (CFH tm1jhoh und HtrA1 tm1jhoh) sowie die anderen Mitglieder HtrA- Familie bekannt wurden erzeugt: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) und HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Die Keimbahn Vorprägungen wurden konstruiert durch Kreuzung OzCre Mäuse Tiere erstellt spezifische Exons mit loxP – Stellen zu flankieren, so dass das Löschen bewirkt eine Rahmenverschiebung und / oder Löschung der aktiven Domäne (CFH; Exon 3, HtrA1; Exons 2-3, HtrA2: Exons 2-4, HtrA3; Exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Ein neuronales Deletion HtrA2, deletiert unter Verwendung von Cre – Rekombinase unter der Kontrolle des Nestin – Promotor (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), wurde ebenfalls 34 beschrieben. Nur Mäuse HtrA2, entweder systemisch oder in Nervengewebe, zeigte klare Phänotypen fehlt, mit Parkinson- Phänotypen zu präsentieren.
Da einige dieser Gene von Interesse gesetzt zu Mitochondrien 11,44-47 lokalisiert werden, und Löschen von HtrA2 erzeugt Parkinsonian Phänotypen, eine Phänotypisierung Regime mit einer mitochondrialen und neurologischen Fokus wird hier beschrieben und repräsentative Ergebnisse aus den Tests von Interesse zur Verfügung gestellt werden . Um gentechnisch veränderten Mäusen zu untersuchen, erzeugt ein Mensch zu untersuchen, gründlich altersbedingte Krankheiten und systematisch eine anfängliche Phänotypisierung Zeitplan festgelegt wurde, die aus einer Reihe von Tests an den beiden HauptbezogenenKrankheiten von Interesse: AMD und Parkinson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Robust Behandlungen notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen menschlichen Alterungs Bezug zu begrenzen, aber sie bleiben schwer für viele Bedingungen. Um potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention, die Ursachen und die Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten müssen zuerst verstanden werden. Nicht alle genetisch veränderten Mäusen unmittelbar gegenwärtig mit klaren Phänotypen, die für die Krankheit von Interesse verbunde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung für diese Forschung kam von Rosebay Medical Foundation und Yale Medical School Deans Research Fund (JH). Wir danken Dr. Claire Koenig für die Hilfe bei Verhaltensexperimenten. Gentechnisch veränderte Mauslinien wurden bei Ozgene (Perth, Australien) erzeugt.
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch’s membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
