Un régimen del fenotipo de ratones genéticamente modificados empleadas para el estudio genes implicados en enfermedades humanas de envejecimiento
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
enfermedades asociados con la edad son cada vez más frecuentes en la sociedad moderna. A medida que la ciencia médica mejora y aumenta la esperanza de vida, la población continúa envejeciendo y la carga de estas enfermedades crece. Los tratamientos eficaces son necesarias para disminuir el impacto de enfermedades debilitantes, pero sigue siendo difícil en muchos casos. Sólo mediante la comprensión de las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento pueden los científicos comenzar a identificar posibles dianas terapéuticas y desarrollar estrategias de intervención. Las condiciones comunes relacionadas con la edad incluyen trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson (EP) y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). PD es el trastorno del movimiento más común causada por neurodegeneración en los seres humanos. La mayoría de los pacientes con EP muestran síntomas como temblor en reposo, bradicinesia y rigidez después de 50 años de edad. El inicio temprano también se ha observado en aproximadamente el 10% de los casos.
La DMAE es la principal causa de ceguera enlos ancianos, dañando progresivamente fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en el ojo. La visión central se ve afectada pero la visión periférica es generalmente no afectado. Hay dos formas de DMAE. En la forma "seca", los depósitos de proteínas extracelulares conocidas como forma de drusas entre el EPR y la membrana de Bruch (BM), que conduce a la atrofia geográfica y la difuminación de la visión central. Los resultados más graves forma "húmeda" de la neovascularización de la coroides a través de BM en las capas del EPR y fotorreceptoras y pueden conducir a hamorrhaging debajo de la retina que causa daño permanente al tejido de la retina. Genoma estudios de asociación de ancho han identificado previamente loci que están asociadas con una mayor susceptibilidad a esta enfermedad y identificó dos regiones de interés: el factor H del complemento (CFH) en el cromosoma 1 y la 10q26 locus, donde la maculopatía susceptibilidad relacionada con la edad 2 (ARMS2) y alta temperatura factor de requerimiento A1 (HTRA1) los genes se encuentran 1-5 </sup>. Las combinaciones de estos alelos aumentan la probabilidad de AMD de una manera dependiente de la dosis y SNPs específicos se pueden asociar preferentemente con cualquiera de las formas húmedas o secas de AMD 3-6.
CFH actúa como un regulador negativo de la vía alternativa (AP) del sistema del complemento mediante la inhibición de la activación de C3. Un polimorfismo de nucleótido único (SNP) se ha relacionado con un mayor riesgo de AMD, causando intercambio de tirosina 402 en el exón 9 con histidina debido a una T a C sustitución 1. En AMD se cree que el AP es misregulated debido a una pérdida de la función de CFH pero si el SNP juega un papel causal no está claro. Una hipótesis es que la histidina cargada positivamente se piensa para negar la posibilidad de CFH para unirse a las proteínas que interactúan proteína C reactiva y el sulfato de heparina 1,7. Los estudios in vitro de CFH Y402H proporcionan resultados contradictorios sobre diferencias funcionales entre las variantes, y en vivo en el trabajo <em> Cfh – / – ratones que expresan humanizado CFH está en curso 8. ARMS2 se encuentra aguas arriba de HtrA1 en el genoma de los primates, aunque el gen está ausente en los ratones. HtrA1 es una serina proteasa, pero ARMS2 está mal caracterizada. El desequilibrio de ligamiento entre los SNPs en el locus asociado a AMD ha hecho que sea difícil determinar las contribuciones al riesgo de mutaciones individuales de los genes en esta región, pero trabajos recientes han sugerido que es la sobreexpresión de HtrA1 en lugar de ARMS2 que conduce a la neovascularización y depósitos de proteínas subretinianas 9-11. Sin embargo, la proximidad de los genes en este locus puede permitir interacciones que no pueden ser estudiados utilizando transgenes insertados aleatoriamente.
Además de AMD, la familia HtrA de serina proteasas se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Todas las proteínas HtrA contienen un dominio de serina proteasa seguido por al menos un dominio PDZ C-terminal. HtrA1, HtrA3 y HtrA4 comparten el grhomología comieres, que consta de un dominio de péptido señal, la unión del factor de crecimiento similar a la insulina, un inhibidor de la proteasa de dominio Kazal, el dominio de serina proteasa y un dominio PDZ. HtrA2 tiene un extremo N-terminal diferente, compuesta de una secuencia de localización mitocondrial, dominio transmembrana y el inhibidor de dominio de unión a la apoptosis seguido por los dominios de la proteasa y PDZ 12-16. HtrA1 mamíferos está regulado por la remodelación inducido por el sustrato en el sitio activo de su dominio de proteasa 17-20, y HtrA2 también puede ser modulada por la interacción entre la serina proteasa y dominios PDZ que suprime la actividad de la proteasa 21. Curiosamente, el dominio PDZ no parece conferir regulación similar a HtrA3 16. Las proteasas HtrA también pueden ser reguladas por factores extrínsecos: se ha demostrado recientemente que existe una interacción entre regulador HtrA1 y protoporfirinas 22 y HtrA2 pueden ser reguladas por la fosforilación tras la activación de la p38 MAP quinasavía de una manera dependiente de PINK1 23. La supresión de los miembros individuales de la familia HtrA en ratones se ha documentado, sin embargo efectos mecanicistas sobre todo no están claros en parte debido a la falta de fenotipos visibles.
HtrA1 desempeña una función importante en el control de calidad de proteínas y su regulación deficiente o mutación se ha asociado con muchas enfermedades humanas diferentes, incluyendo la artritis, el cáncer y un mayor riesgo de AMD 3,4,24-32. La pérdida de función HtrA2 en los tejidos neuronales se ha asociado con fenotipos PD en los seres humanos y los ratones, mientras que su pérdida a partir de tejidos no neurales resultados en envejecimiento acelerado 33-37. Desregulación HtrA3 se ha asociado con enfermedades que incluyen preeclampsia y ciertos tipos de cáncer 38,39. Sobre regulación de HtrA4 se ha observado en las placentas de pacientes con preeclampsia, pero los ratones knockout no muestran un fenotipo abierta 40,41. La falta de fenotipos observados en algunos ratones knockout ha sidopostula que ser el resultado de la compensación entre el miembro de la familia HtrA: se cree que tanto HtrA4 y HtrA1 interactuar con la familia TGF-B de las proteínas, lo que permite la compensación por HtrA1 a la supresión de HtrA4 41. Del mismo modo, se piensa que desde HtrA1 y HtrA3 tienen un alto grado de homología de dominio que podrían tener funciones complementarias 42. Sin embargo, se ha sugerido que las proteínas HtrA pueden tener papeles parcialmente antagónicos, compitiendo para regular objetivos comunes 43.
Para investigar más a fondo estos factores de riesgo se generaron tres líneas de ratones humanizados knock-in. En Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh y TM2 Cfh (CFH * 9) jhoh, el exón 9 del gen Cfh se sustituye con el exón 9 del homólogo humano. TM1 Cfh (CFH * 9) jhoh codifica la tirosina no enfermedad asociada resto en la posición 402, mientras que Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh lleva el Y402H, SNP riesgo asociado. EnARMS2 tm1jhoh la secuencia ARMS2 humana fue dirigida a una región aguas arriba de HtrA1. Una secuencia de parada loxP-flanqueado colocado aguas arriba de la secuencia del gen, pero aguas abajo del promotor UBIC incluido se escindió mediante el cruce de ratones OzCre, que expresan la recombinasa Cre bajo el control del promotor de Rosa26, como se describió anteriormente 34. Además de estos knock-in líneas, se generaron alelos knockout condicional para Cfh y HtrA1 (Cfh tm1jhoh y tm1jhoh HtrA1), así como los demás miembros de la familia HtrA conocidos: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) y HtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). Los agujeros ciegos de la línea germinal se crearon mediante el cruce de ratones OzCre a animales modificados para flanquear exones específicos con sitios loxP, tales que la supresión provoca un cambio de marco y / o supresión del dominio activo (Cfh; exón 3, HtrA1; exones 2-3, HtrA2: exones 2-4, HtrA3; exón 3, HtrA4; exones 4-6) 34,41. Una deleción neural de HtrA2, elimina el uso de la recombinasa Cre bajo el control del promotor de nestina (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), también se ha descrito 34. Sólo los ratones que carecen de HtrA2, sistémica o en los tejidos neuronales, muestran fenotipos claros, que presentan fenotipos parkinsonianos.
Dado que algunos de estos genes de interés se postulan para ser localizado en las mitocondrias 11,44-47, y la supresión de HtrA2 generó fenotipos parkinsonianos, un régimen de fenotipificación con un enfoque mitocondrial y neurológico se describen aquí y se proporcionan resultados representativos de las pruebas de interés . Con el fin de examinar ratones genéticamente modificados producidos para investigar humano, la enfermedad relacionada con la edad a fondo y sistemáticamente se estableció un programa inicial fenotipificación, que consiste en una serie de pruebas relacionadas con los dos principalesenfermedades de interés: AMD y el Parkinson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se necesitan tratamientos robustos para limitar el impacto de las condiciones relacionadas con el envejecimiento humano debilitante, pero sigue siendo difícil para muchas condiciones. Para identificar posibles dianas terapéuticas y desarrollar estrategias de intervención, las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento primero deben ser entendidos. No todos los ratones modificados genéticamente inmediatamente presentes con fenotipos claros que están relacionados con la enfermedad de i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los fondos para esta investigación provino de la Fundación Médica Adelfa y el Fondo de Investigación del Decano Facultad de Medicina de la Universidad de Yale (JH). Agradecemos al Dr. Koenig Claire para obtener ayuda con los experimentos de comportamiento. Genéticamente líneas de ratón diseñado se generaron en Ozgene (Perth, Australia).
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
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