A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Связанные с возрастом заболевания становятся все более распространенными в современном обществе. Как медицинская наука и улучшает продолжительность жизни увеличивается, население продолжает стареть и бремя этих заболеваний растет. Эффективные способы лечения необходимы, чтобы уменьшить воздействие изнурительных условий, но остаются недостижимой во многих случаях. Только понимание причин и патологии заболеваний, связанных со старением ученые могут начать идентифицировать потенциальные терапевтические цели и разработать стратегии для вмешательства. Общие условия, связанные с возрастом включают нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона (PD) и возрастной макулярной дегенерации (ВМД). PD является наиболее распространенным нарушением движения, вызванное нейродегенерации у людей. Большинство пациентов PD показывают такие симптомы, как тремор покоя, брадикинезия и жесткость после 50-летнего возраста. Раннее начало также наблюдается примерно в 10% случаев.
AMD является ведущей причиной слепоты впожилых людей, постепенно повреждая фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) в глазу. Центральное зрение ухудшается, но периферийное зрение, как правило, не влияет. Есть две формы AMD. В «сухой» форме, внеклеточные белковые отложения, известные как друзы формы между ПЭС и мембраной Бруха (БМ), что приводит к географической атрофии и размытость центрального зрения. Более серьезные «мокрые» результаты формируются из неоваскуляризации из хориоидеи через БМ в РПЭ и фоторецепторов слоев и может привести к hamorrhaging под сетчатки, что приводит к необратимому повреждению ткани сетчатки. Геном широкие исследования ассоциаций ранее идентифицированы локусы, которые связаны с повышенной восприимчивостью к этому заболеванию и определили две области, представляющие интерес: фактор комплемента H (CFH) на хромосоме 1 и 10q26 локуса, где возрастная макулопатии восприимчивость 2 (ARMS2) и высокотемпературный фактор требования A1 (HTRA1) гены расположены 1-5 </sup>. Комбинации этих аллелей увеличивает вероятность ВМД в зависимости от дозы и специфические ОНП могут быть преимущественно связаны либо с влажной или сухой формы ВМД 3-6.
КЛОХ действует как негативный регулятор альтернативного пути (AP) системы комплемента, путем ингибирования активации С3. Один нуклеотидного полиморфизма (SNP) был связан с повышенным риском AMD, в результате чего обмен тирозина 402 в экзоне 9 с гистидин из – за Т до С замещения 1. В AMD полагают, что точка доступа является misregulated из-за потери функции КЛОХ но SNP играет причинную роль неясно, будет ли. Одна гипотеза состоит в том, что положительно заряженные гистидин , как полагают, свести на нет способность CFH связываться с взаимодействующих белков С-реактивного белка и гепаринсульфат 1,7. В пробирке исследования CFH Y402H обеспечивают противоречивые результаты более функциональных различий между вариантами, и в Vivo работу в <EM> CFH – / – мышей , выражающие гуманизированное CFH продолжается 8. ARMS2 расположена выше по потоку от HTRA1 в геноме приматов, хотя ген отсутствует у мышей. HTRA1 представляет собой серин-протеазы, но ARMS2 плохо охарактеризованы. Неравновесия по сцеплению между ОНП в AMD-ассоциированной локуса затрудняет определить вклад в риск отдельных мутаций генов в этом регионе, но недавняя работа предположил, что избыточная экспрессия HTRA1, а не ARMS2, что приводит к неоваскуляризации и субретинальном белковые отложения 9-11. Тем не менее, близость генов в этом локусе может позволить взаимодействий, которые не могут быть исследованы с помощью случайным образом вставленные трансгенов.
В дополнение к AMD, семейство HtrA сериновых протеаз было связано со многими заболеваниями человека. Все белки HtrA содержат домен сериновой протеазы с последующей по меньшей мере, одного С-концевого домена PDZ. HTRA1, HtrA3 и HtrA4 разделяют грвкусишь от гомологии, состоящий из сигнального пептида, инсулиноподобного фактора роста связывающий домен, домен ингибитора протеазы Kazal, домен сериновой протеазы и домен PDZ. HtrA2 имеет другой N-конец, состоящий из последовательности митохондриальной локализации, трансмембранный домен и ингибитор апоптоза связывающего домена следуют протеазы и PDZ доменов 12-16. Млекопитающим HTRA1 регулируется ремоделирования субстрат-индуцированного в активном центре своей области протеазы 17-20, и HtrA2 также может быть модулирован за счет взаимодействия между сериновых протеаз и PDZ доменами , который подавляет активность протеазы 21. Интересно отметить , что домен PDZ как представляется , не придавать подобное регулирование к HtrA3 16. Протеазы HtrA также можно регулировать с помощью внешних факторов: это было недавно показано , что существует регулирующую взаимодействие между HTRA1 и протопорфиринов 22 и HtrA2 может регулироваться с помощью фосфорилирования при активации р38 МАР – киназыпуть в PINK1-зависимым способом 23. Удаление отдельных членов семьи HtrA у мышей было документально подтверждено, однако механистические эффекты в основном остаются неясными отчасти из-за отсутствия видимых фенотипов.
HTRA1 играет важную роль в контроле качества белка и его misregulation или мутация была связана со многими различными заболеваниями человека , включая артрит, рак и повышенным риском 3,4,24-32 AMD. Потеря функции HtrA2 в нервных тканях было связано с PD фенотипов у людей и мышей, в то время как его потеря от не-нервных тканей приводит к ускоренному старению 33-37. HtrA3 дисрегуляция было связано с болезнями , включая преэклампсии и некоторых видов рака 38,39. Up-регулирование HtrA4 наблюдается в плаценте больных преэклампсией , но нокаутных мышей не обнаруживают явную фенотип 40,41. Отсутствие фенотипов наблюдается у некоторых мышей с былопостулируется результатом компенсации между членами семьи HtrA: считается , что оба HtrA4 и HTRA1 взаимодействуют с TGF-B семейства белков, что позволяет компенсации путем HTRA1 при удалении HtrA4 41. Точно так же, полагают , что , так как HTRA1 и HtrA3 имеют высокую степень гомологии доменов они могут иметь дополнительные функции , 42. Тем не менее, было высказано предположение , что HtrA белки могут иметь частично антагонистические роли, конкурируя регулировать общие цели 43.
Для дальнейшего изучения этих факторов риска были созданы три очеловеченные стук в линии мыши. В CfH TM1 (CFH * 9) jhoh и CfH ТМ2 (CFH * 9) jhoh, экзона 9 гена CFH заменяется экзоне 9 человеческого гомолога. CfH TM1 (CFH * 9) jhoh кодирует без заболевания , связанного тирозин остаток в положении 402, тогда как CfH ТМ2 (CFH * 9) jhoh несет Y402H, риск-ассоциированной SNP. ВARMS2 tm1jhoh человеческой последовательности ARMS2 была направлена на область вверх по течению от HTRA1. LoxP-фланкирован последовательность СТОП помещен выше последовательности гена , но ниже по потоку от включенного UbiC промотора , был вырезан путем скрещивания с мышами OzCre, которые выражают Cre рекомбиназу под контролем промотора Rosa26, как было описано выше 34. В дополнение к этим цепную в линиях, условных нокаута аллеля CfH и HTRA1 (CFH tm1jhoh и HTRA1 tm1jhoh), а также других известных членов семьи HtrA генерировались: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) и HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Нокауты зародышевой линии были созданы путем скрещивания мышей OzCre к животным спроектированных для фланкирования конкретных экзонов с LoxP сайтов, таким образом, что удаление вызывает смещение кадра и / или удаление активного домена (CFH; экзона 3, HTRA1; экзоны 2-3, HtrA2: экзоны 2-4, HtrA3; экзон 3, HtrA4; экзоны 4-6) 34,41. Нейронные удаление HtrA2, удаленные с помощью Cre рекомбиназу под контролем промотора Nestin (HtrA2 Flox; Tg (NES-CRE) 1Kln / J), также был описан 34. Только мыши, лишенные HtrA2, либо системно, либо в нервных тканях, отображаются четкие фенотипы, представляя с паркинсонизмом фенотипов.
Поскольку некоторые из этих генов интерес положенное быть локализованы в митохондриях 11,44-47 и удаление HtrA2 генерируется Parkinsonian фенотипы, режим фенотипирования с митохондриальной и неврологического фокус описан здесь и репрезентативные результаты испытаний , представляющих интерес предоставляются , Для того чтобы исследовать методом генной инженерии мышей, полученные для исследования человека, связанные с возрастом заболевания тщательно и систематически был создан первоначальный график фенотипирования, состоящий из серии испытаний, связанных с двумя основнымизаболевания интерес: AMD и Паркинсона.
Надежные процедуры необходимы, чтобы ограничить влияние изнурительных условий, связанных с старения человека, но они остаются неуловимыми для многих условий. Для того, чтобы определить потенциальные терапевтические цели и разработать стратегии вмешательства, причины и патология заб…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование этого исследования пришли из Rosebay Фонда медицинского и исследовательского фонда Йельского медицинской школе Дина (JH). Мы благодарим доктора Клэр Koenig за помощь в поведенческих экспериментах. Генно-инженерных мышей линий были получены в Ozgene (Перт, Австралия).
Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
cotton balls | Walmart | ||
heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
9oz Clear Cups | Walmart | ||
1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
Video camera tripod | Amazon | ||
Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |