En fenotyping Regime for genmodifiserte mus brukes til å studere gener involvert i Human Sykdommer i Aging

Summary

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Abstract

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

Introduction

Alders assosierte sykdommer blir stadig mer utbredt i moderne samfunn. Som medisinsk vitenskap forbedrer og levealderen øker, fortsetter befolkningen til alder og byrden av disse sykdommene vokser. Effektive behandlinger er nødvendige for å redusere virkningen av ødeleggende forhold, men forblir unnvikende i mange tilfeller. Bare ved å forstå årsaker og patologi av sykdommer forbundet med aldring kan forskerne begynne å identifisere potensielle terapeutiske mål og utvikle strategier for intervensjon. Vanlige aldersrelaterte forholdene omfatter nevrodegenerative lidelser som Parkinsons sykdom (PD) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). PD er den mest vanlige bevegelsesforstyrrelse forårsaket av neurodegenerering hos mennesker. De fleste PD pasienter viser symptomer som hviler tremor, bradykinesi og stivhet etter 50 års alder. Tidlig debut har også blitt observert hos omtrent 10% av tilfellene.

AMD er den ledende årsak til blindhet ieldre, gradvis skadelige fotoreseptorer og retinal pigment epitel (RPE) i øyet. Central visjon er svekket, men sidesynet er generelt upåvirket. Det er to former for AMD. I "tørr" form, ekstracellulære protein innskudd kjent som drusen form mellom RPE og Bruch membran (BM), som fører til geografisk atrofi og uskarphet av sentral visjon. De mer alvorlige "våte" skjema resultater fra neovascularization fra årehinnen over BM inn RPE og fotoreseptorlidelser lag og kan føre til hamorrhaging under netthinnen som forårsaker permanent skade retinal vev. Genom brede assosiasjonsstudier har tidligere identifisert loci som er assosiert med økt mottakelighet for denne sykdommen, og identifisert to områder av interesse: komplement faktor H (CFH) på kromosom 1 og 10q26 locus, hvor aldersrelatert maculopathy mottakelighet 2 (ARMS2) og høy temperatur kravet faktor A1 (HtrA1) gener er plassert ^1-5 </sup>. Kombinasjoner av disse alleler øker sannsynligheten for AMD på en doseavhengig måte og spesifikke SNP'er kan fortrinnsvis assosiert med enten våte eller tørre former av AMD ^3-6.

CFH virker som en negativ regulator av den alternative reaksjonsvei (AP) av komplementsystemet ved å hemme aktivering av C3. En enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) har vært knyttet til økt risiko for AMD, forårsaker utveksling av tyrosin 402 i exon 9 med histidin grunn av en T til C substitusjon ^1. I AMD er det antatt at AP er misregulated på grunn av et tap av funksjon av CFH men om SNP spiller en kausal rolle er uklar. En hypotese er at den positivt ladede histidin er tenkt å oppheve muligheten for CFH til å bindes til proteiner i samspill C-reaktivt protein og heparinsulfat ^1,7. In vitro-studier av CFH Y402H gir motstridende resultater i løpet av funksjonelle forskjeller mellom variantene, og i vivo arbeid i <em> CFH ^{– / –} mus som uttrykker humanisert CFH pågår ^åtte. ARMS2 befinner seg oppstrøms for HtrA1 i primat genomet, selv om genet er fraværende hos mus. HtrA1 er en serin protease men ARMS2 er dårlig karakterisert. Den koblingsulikevekt mellom SNPs i AMD-assosiert locus har gjort det vanskelig å bestemme bidrag til risiko for enkelte mutasjoner av genene i denne regionen, men nyere arbeid har foreslått at det er overekspresjon av HtrA1 snarere enn ARMS2 som fører til neovascularization og subretinal protein innskudd ^9-11. Imidlertid kan nærhet av genene i denne locus tillate for interaksjoner som ikke kan studeres ved hjelp av tilfeldig satt transgener.

I tillegg til AMD, har HtrA familien av serinproteaser vært forbundet med mange menneskelige sykdommer. Alle HtrA proteiner inneholder en serin protease domene, etterfulgt av minst en C-terminal PDZ domene. HtrA1, HtrA3 og HtrA4 dele greter av homologi, som består av et signalpeptid, insulinlignende vekstfaktorbindende domene, et Kazal proteaseinhibitor domene, serin protease domene og et PDZ domene. HtrA2 har en annen N-terminal, bestående av en mitokondriell lokaliseringssekvens, transmembrandomene og inhibitor av apoptose bindende domene, etterfulgt av protease og PDZ domener ^12-16. Pattedyr HtrA1 reguleres av substrat-indusert ombygging i det aktive sete av den protease domene ^17-20, og HtrA2 kan også moduleres ved interaksjon mellom serin protease og PDZ domener som undertrykker proteaseaktivitet ^21. Interessant, ikke PDZ domene ikke ut til å gi tilsvarende regulering til HtrA3 ^16. De HtrA proteaser kan også være regulert av ytre faktorer: det ble nylig demonstrert at det eksisterer en regulerende samspill mellom HtrA1 og protoporfyriner ²² og HtrA2 kan reguleres ved fosforylering ved aktivering av p38 MAP kinasebanen i en Nature1 avhengig måte ^23. Slettingen av individuelle medlemmer av familien HtrA i mus er blitt dokumentert, men mekanistiske effekter for det meste er uklare delvis på grunn av mangel på synlig fenotyper.

HtrA1 spiller en viktig funksjon i protein kvalitetskontroll og dens misregulation eller mutasjon har vært forbundet med mange forskjellige humane sykdommer, inkludert artritt, cancer og en økt risiko for AMD ^3,4,24-32. Tap av HtrA2 funksjon i nervevev har vært forbundet med PD-fenotyper i mennesker og mus, mens dens tap fra ikke-neurale vev resulterer i akselerert aldring ^33-37. HtrA3 dysregulering har blitt assosiert med sykdommer, inkludert preeklampsi og visse typer kreft ^38,39. Oppregulering av HtrA4 har blitt observert i placentas av preeklampsi pasienter, men knockout mus viser ikke en åpenlys fenotype ^40,41. Mangelen på fenotyper observert hos noen knockout-mus har værtantatt å være et resultat av kompensasjon mellom HtrA familiemedlem: det er antatt at både HtrA4 og HtrA1 samhandle med TGF-B familien av proteiner, noe som åpner for erstatning etter HtrA1 ved sletting av HtrA4 ^41. Tilsvarende er det tenkt at siden HtrA1 og HtrA3 har en høy grad av domene homologies de kan ha ekstra funksjoner ^42. Det har imidlertid vært antydet at HtrA proteiner kan ha delvis antagonistiske roller, konkurrerer om å regulere felles mål ^43.

For ytterligere å undersøke disse risikofaktorene tre humanisert knock-in mus linjer ble generert. I CFH ^{TM1 (CFH * 9) jhoh} og CFH ^{tm2 (CFH * 9) jhoh,} ekson 9 av CFH genet er erstattet med ekson 9 av menneske homolog. CFH ^{TM1 (CFH * 9) jhoh} koder ikke-sykdom assosiert tyrosin rest i posisjon 402, mens CFH ^{tm2 (CFH * 9) jhoh} bærer Y402H, risiko-assosiert SNP. IARMS2 ^tm1jhoh menneske ARMS2 sekvensen ble rettet mot en region oppstrøms HtrA1. En loxP-flankert STOP sekvens plassert oppstrøms av gensekvensen, men nedstrøms for det inkluderte UbiC promoteren ble kuttet ut av krysset til OzCre mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av den Rosa26 promoteren, som tidligere beskrevet ^34. I tillegg til disse knock-in linjer, ble betinget knockout alleler for CFH og HtrA1 (CFH ^tm1jhoh og HtrA1 ^tm1jhoh), samt andre kjente HtrA familiemedlemmer generert: HtrA2 (HtrA2 ^tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 ^tm1jhoh) og HtrA4 ( HtrA4 ^tm1jhoh). De bakterie linjer knockouts ble skapt ved å krysse OzCre mus til dyr konstruert for å flankere spesifikke eksoner med loxP nettsteder, slik at sletting forårsaker en ramme skift og / eller sletting av det aktive domenet (CFH, ekson 3, HtrA1; eksoner 2-3, HtrA2: eksoner 2-4, HtrA3; ekson 3, HtrA4; eksoner 4-6) ^34,41. En nevrale sletting av HtrA2, slettes med Cre rekombinase under kontroll av nestin promoter (HtrA2 ^FLOX, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J), har også blitt beskrevet ^34. Bare mus mangler HtrA2, enten systemisk eller i nervevev, vises klare fenotyper, presenterer med Parkinson fenotyper.

Siden noen av disse genene av interesse er hevdet å være lokalisert til mitokondriene ^11,44-47, og sletting av HtrA2 generert Parkinson fenotyper, en fenotyping diett med en mitokondrie og nevrologisk fokus er beskrevet her og representative resultater fra testene av interesse er gitt . For å undersøke genetisk modifiserte mus produsert for å undersøke humant, aldersrelatert sykdom grundig og systematisk en innledende fenotyping plan etablert, som består av en serie av tester med hensyn til de to hovedsykdommer av interesse: AMD og Parkinsons.

Protocol

Etikk uttalelse: Studier med dyr ble utført i samsvar med National Institutes of Health anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Yale University. 1. Behavioral Testing av genmodifiserte mus Merk: Alle mus skulle bli utsatt for den samme måleprogram for å begrense forskjeller i tilvenning til håndtering. Tester skal utføres på samme tid på dagen hver gang. Neonatal Hind Lim…

Representative Results

Denne delen beskriver eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av disse metoder. I bakbenet test, antall trekk forsøk gjort og ventetid for å falle blir summert over to påfølgende tester for hver dag. Denne testen kan anvendes for å sammenligne genetisk forskjellige grupper for å skille mus med redusert nevromuskulær styrke HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) mus i Figur 1A -. B viser ingen endring i antall trekker og ventetid f…

Discussion

Robuste behandlinger er nødvendig for å begrense virkningen av ødeleggende forhold knyttet til menneskelig aldring, men de forblir unnvikende for mange forhold. For å identifisere potensielle terapeutiske mål og utvikle strategier for intervensjon, må årsaker og patologi av sykdommer knyttet til aldring først bli forstått. Ikke alle genetisk modifiserte mus umiddelbart til stede med klare fenotyper som er relatert til sykdommen av interesse, selv om disse genene har blitt koblet til den tilstand i humane studie…

Materials

Ethanol	Decon (Fisher Scientific)	435541
50 ml conical tube	Fisher Scientific	1443222
cotton balls	Walmart
heat mat	Sunbeam	0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray)	Walmart
Electronic stopwatch	GOGO	PC396
Plexiglass box	constructed in workshop		12" by 12"
Vixia HF R400 Camcorder	Canon	8155B004
9oz Clear Cups	Walmart
1/4 inch wire mesh	Home Depot	204331884 (online) / 554219 (in store)	12" by 12"
Bubble wrap	VWR	470092-416
Straight specimen forceps	VWR	82027-438
Fine-tip dissecting forceps	VWR	82027-408
Fine scissors	VWR	82027-578
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4	American Bioanalytical	AB11072-04000
Sucrose	JT Baker	4072-01
superfrost slides	Fisher Scientific	12-550-15
Hematoxylin Stain Solution	Fisher Scientific (Ricca)	353016
Eosin Y Stain Solution	Fisher Scientific (Ricca)	2845-32
Tris hydrochloride	Sigma	T3253
Tris	American Bioanalytical	AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate	Sigma	N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride	Sigma	N6876
Acetone	JT Baker	9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma	S2378
VectaMount aqueous mounting medium	Vector Labs	H-5501-60
Cover glass	Fisher Scientific	12-545-M	60 x 24 mm
AxioImager A1 microscope	Zeiss
Video camera tripod	Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT)	Fischer Scientific	23730571
Cryostat Sectioning  Machine	Leica	CM1900	Discontinued but since replaced by CM1950