Helautomatisk Sentrifugal mikrofluid Enhet for Ultra Protein Detection fra Whole Blood
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Flere plattformer for sykdom diagnose har blitt utviklet basert på nanoskala materialer 1,2 eksempel nanotråder, 3 nanopartikler, 4 nanorør, 5 og nanofibers (NFS) 6-8. Disse nanomaterialer har gode utsikter i utformingen av nye teknologier for svært sensitive bioassay grunn av deres unike fysiske og kjemiske egenskaper. For eksempel har mesoporous sink oksid nanofibers blitt brukt for femto-molar sensitiv deteksjon av brystkreft biomarkører. 9 Nylig nanomaterialer basert på titandioksid (TiO2) har blitt undersøkt for Bioanalytical applikasjoner 10 vurderer sin kjemiske stabilitet, 11 ubetydelig protein denaturering , 12 og biokompatibilitet. 13 i tillegg er de hydroksylgrupper på overflaten av TiO 2 lette kjemisk modifikasjon og kovalent binding av biomolekyler. 14,15 mønstret TiO 2 thin filmer 16 eller TiO 2 nanorørene 17 er blitt benyttet for å forbedre deteksjonsfølsomheten av et mål-protein ved å øke overflatearealet; imidlertid, er fremstillingsprosessen ganske komplisert og krever kostbart utstyr. På den annen side er elektrospunnede NFS mottar oppmerksomhet på grunn av deres høyt overflateareal, så vel som enkel og billig fremstillingsprosess; 18,19 ennå, den skjøre eller løs karakteristisk for elektrospunnede TiO 2 NF matten gjør det vanskelig å håndtere og integreres med microfluidic enheter. 6,20 ble derfor TiO 2 NF matter sjelden benyttet i Bioanalytical anvendelser, spesielt de som krever sterke vaskebetingelser.
I denne studien, for å overvinne disse begrensninger har vi utviklet en ny teknologi for overføring av elektrospunnede NF matter på overflaten av enhver target-substrat ved å benytte en tynn polydimetylsiloksan (PDMS) klebesjikt. furthermore, har vi lykkes viste integreringen av elektrospunnede TiO to NF-matter på en sentrifugal-mikrofluidanordning fremstilt av polykarbonat (PC). Ved hjelp av denne anordning, ble en høy-følsom, helautomatisk, og integrert påvisning av C-reaktivt protein (CRP), så vel som hjerte troponin I (cTnI) oppnådd i løpet av 30 min fra bare 10 ul av fullblod. 21 På grunn av den kombinerte fordelene med egenskapene til NFS og sentrifugal plattformen, analysen viste et bredt dynamisk område av seks størrelsesordener fra 1 pg / ml (~ 8 FM) til 100 ng / ml (~ 0,8 pM) med en nedre deteksjonsgrense på 0,8 pg / ml (~ 6 FM) for CRP og et dynamisk område fra 10 pg / ml (~ 0,4 pm) til 100 ng / ml (~ 4 nM) med en påvisningsgrense på 37 pg / ml (~ 1,5 pM) for cTnI. Disse deteksjonsgrenser er ~ 300 ~ og 20-ganger lavere enn de tilsvarende konvensjonelle ELISA-resultater. Denne teknikken kan anvendes for påvisning av enhver target-proteiner, med passende antistoffer. Samlet sett denne enheten could bidra sterkt til in vitro-diagnostikk og biokjemiske analyser, siden det kan detektere sjeldne mengder av target-proteiner med stor følsomhet, selv fra meget små mengder av biologiske prøver, for eksempel, 10 pl fullblod. Selv om vi bare vist serumproteindeteksjon ved hjelp av ELISA i denne studien, kan overføring og integrering teknologi av elektrospunnede NFS med microfluidic enhetene være mer bredt anvendt i andre biokjemiske reaksjoner som krever et stort overflateareal for høy deteksjonsfølsomhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen på TiO 2 NF integrert plate er en hurtig, billig og praktisk teknikk for ultra påvisning av lave rikelig proteiner tilstede i meget lave volumet av blod. Denne teknikken har den fordelen av å bruke små prøvevolumer (10 ul), og er mottagelig for analyse av flere prøver samtidig. Dette gir et stort potensial som en multiplexing immunoassay enhet. Enheten har den ekstra fordelen at den ikke krever prøve forbehandlingstrinn som plasma separasjon, som er nødvendig i konvensjonelle ELISA. Dessuten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), et stipend fra den koreanske Health Technology R & D Project, Ministry of Health & Welfare (A121994) og IBS-R020-D1 finansiert av den koreanske regjeringen.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
- Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
