Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Summary

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Abstract

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introduction

Várias plataformas para o diagnóstico da doença foram desenvolvidos com base em materiais em nanoescala ^1,2 tais como nanofios, ³ nanopartículas, nanotubos de ^{4, 5} e nanofibras (NFS) ^6-8. Estes nanomateriais oferecem excelentes perspectivas na concepção de novas tecnologias para bioensaios altamente sensíveis devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Por exemplo, nanofibras de óxido de zinco mesoporosa têm sido utilizados para a detecção sensível de femto-molar de biomarcadores de cancro da mama. ⁹ Recentemente, os nanomateriais à base de dióxido de titânio (TiO ₂₎ têm sido exploradas para aplicações bioanaliticas ¹⁰ considerando-se a sua estabilidade química, ¹¹ desnaturação de proteínas negligenciável , ¹² e biocompatibilidade. ¹³ Além disso, os grupos hidroxilo na superfície de _TiO2 facilitar a modificação química e a ligação covalente de biomoléculas. modelado ^14,15 TiO ₂ thin películas ¹⁶ ou ¹⁷ TiO ₂ nanotubos têm sido utilizados para aumentar a sensibilidade de detecção de uma proteína-alvo, aumentando a área de superfície; No entanto, o processo de fabricação é bastante complexo e requer um equipamento caro. Por outro lado, as FN electrospun estão a receber atenção devido à sua elevada área de superfície, bem como processo de fabrico simples e de baixo custo; ^18,19 ainda, a característica frágil ou solto da esteira electrospun TiO ₂ NF torna difícil de manusear e integrar com dispositivos microfluídicos. ^6,20 Portanto, os TiO ₂ esteiras NF raramente foram utilizados em aplicações bioanalíticos, particularmente aquelas que requerem condições de lavagem agressivos.

Neste estudo, para ultrapassar estas limitações, desenvolvemos uma nova tecnologia para a transferência do electrospun NF esteiras sobre a superfície de qualquer substrato alvo, utilizando uma camada de adesivo fina polidimetilsiloxano (PDMS). Furthermore, que demonstraram com sucesso a integração de electrospun TiO ₂ NF esteiras para um dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). Usando este dispositivo, uma detecção sensível de alta, totalmente automatizada e integrada de proteína C-reactiva (CRP), bem como a troponina I cardíaca (TIc) foi alcançada em 30 min a partir de apenas 10 ul de sangue total. ²¹ Devido ao combinado vantagens das propriedades da FN e a plataforma de centrífuga, o ensaio apresentava uma vasta gama dinâmica de seis ordens de grandeza a partir de 1 pg / ml (~ 8 fm) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) com um limite de detecção inferior de 0,8 pg / ml (~ 6 fm) para PCR e uma faixa dinâmica de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) e 100 ng / ml (~ 4 nM) com um limite de detecção de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) para cTnI. Estes limites de detecção são ~ 300 e ~ 20 vezes mais baixa em comparação com os seus correspondentes resultados de ELISA convencionais. Esta técnica pode ser aplicada para a detecção de quaisquer proteínas alvo, com anticorpos apropriados. No geral, este co dispositivould contribuir grandemente para diagnóstico in-vitro e ensaios bioquímicos uma vez que pode detectar quantidades raros de proteínas-alvo com grande sensibilidade mesmo a partir de quantidades muito pequenas de amostras biológicas, por exemplo, 10 ml de sangue total. Embora apenas se demonstrou a detecção de proteína de soro utilizando ELISA no presente estudo, a tecnologia de transferência e integração de electrospun FN com dispositivos de microfluidos pode ser mais amplamente aplicado em outras reacções bioquímicas que requerem uma grande área de superfície para detecção de alta sensibilidade.

Protocol

NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis ​​e foi recolhido em um tubo de coleta de sangue. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os voluntários. 1. Fabricação de TiO 2 NF Mat Preparação da solução precursora de 22 Dissolve-se 1,5 g de tetra-isopropóxido de titânio (TTIP) numa mistura de etanol (99,9%, 3 ml) e ácido acético glacial (3 ml) e misturar a solução à TA (25 …

Representative Results

Usando este protocolo, um dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para a detecção de proteína a partir de sangue inteiro com elevada sensibilidade foi preparado. As esteiras de TiO 2 NF foram preparados por processos de electrospinning e calcinação. A fim de fabricar o diâmetro desejado de FN, morfologia, e sua espessura, electrospinning condições tais como a taxa de fluxo, tensão, e o tempo de fiação foram optimizados. Quando as condições …

Discussion

O ensaio em TiO ₂ NF disco integrada é uma técnica rápida, barata e conveniente para a detecção ultra-sensível de baixas proteínas abundantes presentes em muito baixo volume de sangue. Esta técnica tem a vantagem da utilização de pequenos volumes de amostra (10 ul) e é receptivo para a análise de múltiplas amostras em simultâneo. Isto proporciona um grande potencial como um dispositivo de multiplexação de imunoensaio. O dispositivo tem a vantagem adicional de que ele não requer passos de pré…

Materials

Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III – ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software