Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Hastalık tanısı için çeşitli platformlar 1,2 gibi nanotellerin, 3 nanopartiküller, 4 nanotüpler, 5 ve nano (NF'ler) 6-8 olarak nano ölçekli malzemelere dayanan geliştirilmiştir. Bu nano kendi benzersiz fizikokimyasal özellikleri nedeniyle son derece hassas biyoanalizlere için yeni teknolojilerin tasarımı mükemmel umutları sunuyoruz. Örneğin, gözenekli bir çinko oksit nanolifler meme kanseri biyobelirteçlerinin femto-mol hassas bir şekilde tespit kullanılmaktadır. 9. Son zamanlarda, kimyasal stabilitesini göz önüne biyoanalitik edecektir 10 araştırılmıştır (TiO2) titanyum dioksit esaslı sol-jel, 11 ihmal edilebilir protein denatürasyonu 12 ve ek olarak biyouyumluluk. 13, TiO2 yüzeyi üzerindeki hidroksil grupları kimyasal modifikasyon biyomoleküllerin kovalent bağlanmasını kolaylaştırır. 14,15 Desenli TiO2 thin, filmler 16 veya TiO2 17 yüzey alanını arttırarak, bir hedef proteinin algılama hassasiyetini artırmak için kullanılmıştır nanotüpler, Ancak, üretim süreci oldukça karmaşık ve pahalı ekipman gerektirir. Öte yandan, electrospun NF'ler basit ve düşük maliyetli üretim süreci yanı sıra nedeniyle yüksek yüzey alanı dikkatini alıyorsanız, 18,19 henüz electrospun TiO2 NF mat kırılgan ya da gevşek özelliği işlemek için zorlaştırır ve mikroakışkan cihazlar ile entegre. 6,20 nedenle, TiO2 NF paspaslar nadiren biyoanalitik uygulamalarda sert yıkama koşulları gerektiren özellikle kullanılmıştır.
Bu çalışmada, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için, ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) yapışkan tabaka kullanarak, herhangi bir hedef alt-tabakanın yüzeyi üzerine, NF halılar electrospun aktarmak için yeni bir teknoloji geliştirilmiştir. furthermore, başarılı polikarbonat (PC) yapılan bir santrifüj mikroakışkan cihaz üzerine electrospun TiO NF paspaslar 2 entegrasyonunu gösterdi. Bu cihazı kullanarak, C-reaktif protein, hassas bir yüksek tam otomatik ve entegre (CRP) ve kardiyak troponin I (cTnl) tam kan sadece 10 uL, 30 dakika içinde elde edilmiştir. 21 nedeniyle birleştirilebilir UF ve merkezkaç platformun özelliklerinin avantajları, deney alt saptama sınırı 100 ng / ml (~ 12:08) 1 ug / ml (~ 8 FM) den altı mertebe geniş bir dinamik aralık sergilemiştir CRP ve 37 pg / ml (~ 01:05) içindeki bir saptama sınırı 100 ng / ml (~ 4 nM), 10 pg / ml (~ 12:04) bir dinamik aralık için 0.8 ug / ml (~ 6 FM) ve cTnI için. Bu tespit limitleri ~ 300 ve 20 Hangi kat bunlara karşılık gelen geleneksel ELISA sonuçlarına göre daha düşük. Bu teknik, uygun antikorlar ile, herhangi bir hedef proteinlerin tespiti için uygulanabilir. Genel olarak, bu cihaz coörneğin, tam kan 10 ul; biyolojik numunelerin çok küçük miktarlarda bile büyük bir hassasiyetle hedef proteinlerin nadir miktarlarda algılayabilir beri uld in vitro diagnostik ve biyokimyasal tahliller büyük katkı. Biz sadece bu çalışmada ELISA kullanılarak serum protein algılama gösterdi rağmen, mikroakışkan cihazlar ile electrospun UF'lerin transferi ve entegrasyon teknolojisi daha geniş yüksek algılama hassasiyeti için büyük bir yüzey alanı gerektiren diğer biyokimyasal reaksiyonlarda uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
TiO2 NF entegre disk üzerinde deney kan çok düşük hacimde, düşük fazla proteinler arasında derece hassas saptanması için hızlı, ucuz ve kullanışlı bir yöntemdir. Bu teknik, küçük örnek hacimlerini (10 ul) kullanılarak avantajı vardır ve aynı anda birden fazla numune analiz için elverişlidir. Bu bir çoklayıcı immunoassay cihazı olarak büyük bir potansiyel sunmaktadır. Cihaz, geleneksel ELISA gereklidir plazma ayrılması gibi örnek ön-işlem aşamaları gerekli değildir ila…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) hibeler (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), Kore Hükümeti tarafından finanse edilen Kore Sağlık Teknoloji Ar-Ge Projesi, Sağlık ve Refah (A121994) ve IBS-R020-D1 Bakanlığı'ndan bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
- Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
