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Biology

नीलम और OPO लेजर आधारित मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप: तिवारी पर एक सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (कार) प्रणाली के कार्यान्वयन

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54262
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,5, 4, 1
1INSERM U1051, Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier, 2Université de Nîmes, 3CNRS, IES, UMR 5214, 4Aix-Marseille Université, CNRS, École Centrale Marseille, Institut Fresnel, UMR 7249, 5Montpellier RIO Imaging (MRI)
* These authors contributed equally

Summary

सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने (कार) अणु बांड के निहित कंपन के आधार पर माइक्रोस्कोपी लेबल मुक्त रासायनिक चयनात्मक लाइव सेल इमेजिंग परमिट। नीलमणि लेजर और एक OPO लेजर: यह काम एक femtosecond तिवारी के आधार पर एक मानक multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर एक पूरक माइक्रोस्कोपी तकनीक के कार्यान्वयन प्रस्तुत करता है।

Abstract

एक femtosecond तिवारी के संयोजन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप: नीलम लेजर और एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) लेजर लाइन नकल करने जीव के लिए उपलब्ध हो गए हैं। इन प्रणालियों मुख्य रूप से मल्टी चैनल दो photon प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार कर रहे हैं। हालांकि, किसी भी संशोधन के बिना, इस तरह की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) या तीसरे हार्मोनिक पीढ़ी (THG) के रूप में पूरक गैर रेखीय ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी भी इस सेट अप के साथ, की अनुमति संरचित अणुओं या जलीय मध्यम का लेबल मुक्त इमेजिंग किया जा सकता है लिपिड इंटरफेस। इन तकनीकों में अच्छी तरह से इन विवो अवलोकन के लिए अनुकूल हैं, लेकिन रासायनिक विशिष्टता में सीमित कर रहे हैं। रासायनिक चयनात्मक इमेजिंग निहित कंपन रमन बिखरने पर आधारित संकेतों से प्राप्त किया जा सकता है। Confocal रमन माइक्रोस्कोपी 3 डी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, लेकिन यह उच्च औसत शक्ति और लंबे समय के अधिग्रहण के समय की आवश्यकता है। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, लेजर प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों गतिविधियों की अनुमति दी हैnonlinear ऑप्टिकल कंपन माइक्रोस्कोपी के opment, विशेष रूप से सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन में (कार) बिखरने। कारों माइक्रोस्कोपी इसलिए, जैविक और लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है रासायनिक मानचित्रण लिपिड (सीएच खिंचाव कंपन के माध्यम से), पानी (ओएच खिंचाव कंपन के माध्यम से), प्रोटीन या डीएनए से। इस काम में, हम एक मानक OPO युग्मित multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर कारों तकनीक के कार्यान्वयन का वर्णन है। यह समय में लेजर किरण पथ में से एक की लंबाई का समायोजन करके दो लेजर लाइनों के तुल्यकालन पर आधारित है। हम एक मौजूदा multiphoton सिस्टम पर इस तकनीक का एक कदम-दर-कदम कार्यान्वयन प्रस्तुत करते हैं। प्रयोगात्मक प्रकाशिकी में एक बुनियादी पृष्ठभूमि मददगार है और प्रस्तुत प्रणाली महंगा अनुपूरक उपकरण की आवश्यकता नहीं है। हम भी इमेजिंग कारों कृंतक की sciatic तंत्रिका की मेलिन शीथ पर प्राप्त उदाहरण देकर स्पष्ट करना, और हम बताते हैं कि इस तरह के मानक इमेजिंग टी के रूप में अन्य nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग, के साथ एक साथ किया जा सकता हैwo फोटॉन प्रतिदीप्ति तकनीक और दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी।

Introduction

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी एक subcellular संकल्प के साथ जैविक प्रणालियों जीने में गतिशील प्रक्रियाओं का nondestructive दृश्य के लिए एक प्रमुख तकनीक बन गया है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वर्तमान में अपने उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता 1 के कारण सबसे लोकप्रिय इमेजिंग जीवित कोशिकाओं में इस्तेमाल विपरीत है। फ्लोरोसेंट जांच की एक बड़ी पैलेट (बहिर्जात रंजक, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन, अर्धचालक नैनोकणों) में उभरा है। विभिन्न नमूना रोशनी फ्लोरोसेंट आधारित तकनीक (जैसे confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी के रूप में) 3 डी इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए और इस तकनीक जो 2 photobleaching है की एक मुख्य दोष को कम करने के लिए निखरा है। अन्य सीमाओं fluorophore लेबलिंग की आवश्यकता शामिल हैं क्योंकि आणविक प्रजातियों में से सबसे आंतरिक रूप से फ्लोरोसेंट नहीं हैं और इसलिए इन fluorophores कृत्रिम रूप से imaged नमूना में पेश किया जाना है। इस कृत्रिम हेरफेर छोटे अणुओं के लिए विशेष रूप से हानिकारक हो या बर्तन लाती सकता हैential तस्वीर विषाक्तता। इन कारणों से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी नहीं अच्छी तरह से इन विवो टिप्पणियों के लिए अनुकूल बनाते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट अणु के उपयोग के बिना उच्च संवेदनशीलता और विशिष्ट आणविक विरोधाभासों के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के उपयोग के जैव चिकित्सा विज्ञान के क्षेत्र में अत्यधिक वांछनीय है।

लेबलिंग या धुंधला बिना कई nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) 3,4 और तीसरे हार्मोनिक पीढ़ी (THG) 5 सहित उभरा है। एसएचजी माइक्रोस्कोपी ऐसे सूक्ष्मनलिकाएं या कोलेजन के रूप में 6 supramolecular स्तर पर छवि संरचनात्मक व्यवस्था करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। THG इस तरह के एक जलीय मध्यम और लिपिड 7 के बीच इंटरफेस के रूप में ऑप्टिकल विषमताओं से उत्पन्न होता है। THG भी छवि माइलिन 8,9 करने के लिए प्रदर्शन किया गया। दोनों तकनीकों एक दो photon प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर लागू किया जा सकता है और केवल एक लेजर बीम की आवश्यकता होती है। हालांकि वे उच्च शक्ति लेजर तीव्रता की आवश्यकता होती है (आमतौर पर 50स्वयं सहायता समूह के 10, 25 के लिए 860 एनएम पर मेगावाट - 50 मेगावाट THG 9 के लिए 1,180 एनएम) है, जो रहने वाले नमूनों में हानिकारक है, और रासायनिक विशिष्टता है कि स्पष्ट छवि के विशिष्ट जैविक संरचनाओं के लिए आवश्यक है प्रदान नहीं करते पर।

रासायनिक चयनात्मक इमेजिंग निहित आणविक कंपन रमन बिखरने पर आधारित संकेतों से प्राप्त किया जा सकता है। प्रकाश की एक किरण बात हिट, फोटॉनों अवशोषित और परमाणुओं या अणुओं से तितर-बितर हो सकते हैं। बिखरे हुए फोटॉनों के अधिकांश घटना फोटॉनों के रूप में ही ऊर्जा, यानी, आवृत्ति, होगा। इस प्रक्रिया के रेले बिखरने कहा जाता है। हालांकि, फोटॉनों की एक छोटी संख्या एक स्थिर बिखरने प्रक्रिया रमन बिखरने कहा जाता है, के साथ एक ऑप्टिकल आवृत्ति घटना फोटॉनों, यानी की आवृत्ति से अलग पर बिखर जाएगा। ऊर्जा के क्षेत्र में अंतर आणविक संरचना और वातावरण पर निर्भर करता कंपन मोड की उत्तेजना से निकलती है। इसलिए, सहज रमन बिखरने नीतिइडस रासायनिक चयनात्मक इमेजिंग के रूप में विभिन्न अणुओं विशिष्ट कंपन आवृत्तियों की है। हालांकि यह अपने बेहद कमजोर संकेत की वजह से सीमित है। Confocal रमन माइक्रोस्कोपी विकसित किया गया है और 3 डी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, लेकिन यह उच्च औसत शक्ति और लंबे समय के अधिग्रहण के समय 11 की आवश्यकता है। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, लेजर प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों nonlinear ऑप्टिकल कंपन माइक्रोस्कोपी का उदय, विशेष रूप से सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने में (कार) 11,12,13 की अनुमति दी है।

कारों एक तीसरे क्रम nonlinear ऑप्टिकल प्रक्रिया है। तीन लेजर बीम, आवृत्ति ω पी पर एक पंप बीम से बना है, आवृत्ति ω एस पर एक स्टोक्स बीम और एक जांच किरण (सबसे अधिक बार पंप किया जा रहा है) एक नमूने में केंद्रित है और (आवृत्ति ω के रूप में = पर एक विरोधी स्टोक्स किरण उत्पन्न कर रहे हैं 2ω पी - ω एस) 14। विरोधी स्टोक्स संकेत काफी बढ़ाया जा सकता है जब आवृत्ति अंतर(- ω एस ω पी) पंप और स्टोक्स मुस्कराते हुए एक रमन आणविक कंपन Ω आर = को देखते है के बीच। कारों संकेत कई फोटोन बातचीत पर आधारित है। इसलिए यह परिमाण सहज रमन बिखरने की तुलना में मजबूत के एक सुसंगत संकेत के आदेश उत्पन्न करता है।

कारों माइक्रोस्कोपी पहले प्रयोगात्मक डंकन एट अल। 15 द्वारा प्रदर्शन किया गया। Zumbusch एट अल। तो तकनीक में सुधार, उच्च संख्यात्मक एपर्चर का एक उद्देश्य लेंस के साथ दो केंद्रित लगभग अवरक्त femtosecond लेजर बीम का उपयोग कर कारों के चरण मिलान हालत अनुमति देता है और दो ​​photon न सुनाई देती पृष्ठभूमि 16 से बचने के द्वारा। कारों माइक्रोस्कोपी इसलिए, जीना सेल और ऊतकों इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है रासायनिक जीवित कोशिकाओं 19,20 में इस तरह के लिपिड के रूप में अणुओं (सीएच खिंचाव कंपन के माध्यम से) 17,18, पानी (ओएच खिंचाव कंपन के माध्यम से), प्रोटीन, डीएनए का पता लगाने के द्वारा लेकिन यह भी रासायनिक यौगिक deuteratedदवा 21 और कॉस्मेटिक अनुप्रयोगों 22 के लिए है।

nonlinear माइक्रोस्कोपी के प्रमुख सीमा जटिलता और ऑप्टिकल स्रोतों की लागत से निकलती है। एक कार प्रणाली छोटी नाड़ी durations के साथ और अस्थायी और स्थानिक सिंक्रनाइज़ नाड़ी गाड़ियों के साथ दो तरंगदैर्ध्य ट्यून करने योग्य लेज़रों की आवश्यकता है। जल्दी कारों सूक्ष्मदर्शी दो सिंक्रनाइज़ पीकोसैकन्ड तिवारी पर आधारित थे: नीलम लेज़रों 20। नीलमणि लेजर एक supercontinuum प्रकाश स्रोत 23 पैदा: कारों इमेजिंग भी एक femtosecond तिवारी से प्राप्त हुई थी। हाल ही में, एक भी femtosecond तिवारी की रचना की लेजर सूत्रों: नीलम लेजर एक tunable ऑप्टिकल पैरामीट्रिक oscillators (OPO) से पंप कारों माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह सेट-अप आंतरिक रूप से अस्थायी पंप और पूर्ण आणविक कंपन स्पेक्ट्रम को कवर 24 स्टोक्स बीम के बीच आवृत्ति की एक अंतर के साथ मुस्कराते हुए सिंक्रनाइज़ की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक turn- के आधार पर लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपकुंजी FS लेजर और एक OPO, मुख्य रूप से दो photon प्रतिदीप्ति (TPF) के लिए इस्तेमाल अब गैर भौतिक विज्ञानियों के लिए उपलब्ध हैं। इस तरह के सेट-अप की क्षमता बहुत अन्य nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग के समावेश से पूरक निवेश की आवश्यकता के बिना बढ़ाया जा सकता है के बाद से प्रत्येक nonlinear (एनएलओ) इमेजिंग साधन विशिष्ट संरचना या अणुओं के प्रति संवेदनशील है। मल्टीमॉडल एनएलओ इमेजिंग इसलिए जटिल जैविक नमूने 25 एनएलओ माइक्रोस्कोपी के संभावित capitalizes। इन तकनीकों के युग्मन लिपिड चयापचय, त्वचा या कैंसर के विकास 26, कंकाल की मांसपेशी विकास 27, atherosclerotic घावों 28 पर कई जैविक सवालों की जांच की अनुमति दी है, विशेष रूप से। इसके अलावा, कारों के साथ लेजर बीम स्कैनिंग के कार्यान्वयन के उच्च दर इमेजिंग, यानी, विवो में dynamical प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अपील उपकरण की क्षमता देता है।

इस काम का उद्देश्य टी को लागू करने के लिए हर कदम को दिखाने के लिए हैएक मानक multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर वह कारों तकनीक। माइक्रोस्कोप एक FSEC तिवारी पर आधारित है: नीलम लेजर और एक OPO (तिवारी द्वारा पंप: नीलम लेजर) जीव के लिए एक सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित है। एकीकरण के क्रम में समय में दो मुस्कराते हुए सिंक्रनाइज़ करने में लेजर किरण पथ में से एक की लंबाई का समायोजन करके प्रदर्शन किया गया था। हम कदम-दर-कदम इस तकनीक है जो प्रयोगात्मक प्रकाशिकी में केवल बुनियादी पृष्ठभूमि की आवश्यकता के कार्यान्वयन का वर्णन है। हम भी उदाहरण देकर स्पष्ट कारों कृन्तकों के sciatic तंत्रिका की मेलिन शीथ पर प्राप्त इमेजिंग, और हम बताते हैं इस इमेजिंग इस तरह के मानक दो photon प्रतिदीप्ति तकनीक और दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी के रूप में, अन्य nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ एक साथ किया जा सकता है।

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Protocol

आकृति 1
चित्रा 1. सामान्य सेट-अप के योजनाबद्ध दृश्य यह तिवारी शामिल हैं:। नीलम (680 - 1,080 एनएम) और OPO (1050 - 1300) एनएम लेजर, (एम 4 एम 1) 4 दर्पण के साथ विलंब लाइन, तेजी से आस्टसीलस्कप, photodiode और दो ​​निश्चित आईरिस diaphragms मैं 1 और मेरे पास 2। दर्पण एम 2 और एम 3 एक माइक्रोमीटर संकल्प के साथ देरी लाइन की लंबाई को बदलने के लिए सक्षम करने के लिए एक रेखीय अनुवाद मंच पर तय कर रहे हैं। एक 660 -। 685 एनएम बैंड पास फिल्टर का photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) कारों इमेजिंग के लिए इस्तेमाल सामने तैनात किया गया था यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. लेजर सिस्टम के स्टार्टअप

  1. सत्यापित करें कि तिवारी: नीलम तरंग दैर्ध्य 800 एनएम के लिए सेट कर दिया जाता या को परिभाषिततिवारी पर इस तरंग दैर्ध्य: नीलम बिजली की आपूर्ति नियंत्रक। तिवारी पर स्विच करने के लिए पर स्टैंडबाय से महत्वपूर्ण मोड़: लेजर नीलमणि।
  2. OPO नियंत्रक की पीठ पर OPO लेजर पर मुड़ें और तिवारी खोलने: तिवारी पर नीलम शटर: नीलम बिजली की आपूर्ति नियंत्रक।
  3. टैबलेट कंप्यूटर पर स्विच OPO को पंप करने के लिए। टेबलेट पर OPO कनेक्टेड और दूरस्थ जुड़े प्रतीक पर क्लिक करें। ऊपर वार्मिंग के लिए 40 मिनट - 30 के लिए प्रतीक्षा करें।
  4. माइक्रोस्कोप कंप्यूटर पर स्विच और "माइक्रोस्कोप घटक" स्विच पर बारी। सॉफ्टवेयर डबल क्लिक करके डेस्कटॉप पर चिह्न शुरू करो।
  5. सॉफ्टवेयर अधिग्रहण टैब में, सॉफ्टवेयर से दोनों लेज़रों संचालित करने के लिए सेटअप प्रबंधक में लेजर उपकरण खुला। तिवारी का चयन करें: नीलम लेजर पर और पर OPO लेजर। ऑप्टिकल लेजर शक्ति के मूल्य (800 एनएम पर 3,700 मेगावाट की विशिष्ट मूल्यों और 1000 एनएम पर 700 मेगावाट) की जाँच करें।
  6. किरण पथ और पराबैंगनीकिरण कॉन्फ़िगर करने के लिएसेटअप प्रबंधक उपकरण समूह में प्रकाश पथ उपकरण खोलने और जांच पहले photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) बॉक्स।
  7. तिवारी की जाँच करने के उद्देश्य के उत्पादन में नीलम लेजर हाजिर, अधिग्रहण पैरामीटर उपकरण समूह के चैनल उपकरण खुला। चयन करें तिवारी: कम मूल्य (% के आसपास 1) में नीलम बिजली, 0 करने के लिए लाभ (कोई छवि इस स्तर पर की जरूरत है) को कम करने और माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के माध्यम से लेजर बीम को लांच करने के लिए स्कैनिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए सतत बटन पर क्लिक करें। स्थिति हवा माइक्रोस्कोप उद्देश्य (10X) के उत्पादन में आईआर लेजर को देखने कार्ड द्वारा प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा एक लाल जगह की उपस्थिति की जाँच करें।
  8. OPO लेजर मौके की जांच करने के लिए, तिवारी की स्कैन रोक: स्टॉप बटन पर क्लिक करके नीलमणि लेजर। चैनल विंडो में कम मूल्य पर OPO शक्ति का चयन करें और सी पर क्लिक करेंontinuous बटन।

2. माइक्रोस्कोप सेटिंग

  1. मैन्युअल गैर descanned का पता लगाने (NDD) मोड में PMTs में प्रकाश नमूना से 760 समुद्री मील दूर करने के लिए शुरू करने के लिए उद्देश्य nosepiece ऊपर अनंत अंतरिक्ष में sideport स्लाइडर में 760 एनएम पर एक कटऑफ तरंग दैर्ध्य के साथ dichroic दर्पण जगह है।
  2. रिकॉर्ड करने के लिए केवल कारों 670 एनएम पर संकेत इस काम में प्रस्तुत परिणाम प्रतिलिपि PMT1 के सामने NDD परावर्तक घन में 685 एनएम - 660 में संकीर्ण बैंड पास फिल्टर सेट करें।
  3. 500 से माइलिन के प्रतिदीप्ति अवलोकन के लिए PMT3 के सामने NDD परावर्तक घन में 550 एनएम को लेकर एक संकीर्ण बैंड फिल्टर रखें। 565 से स्वयं सहायता समूह के अवलोकन के लिए PMT4 के सामने परावर्तक घन में 610 एनएम को लेकर एक संकीर्ण बैंड फिल्टर रखें।
  4. सॉफ्टवेयर में तदर्थ बैंड पास फिल्टर के साथ डिटेक्टर पर सिग्नल की रिकॉर्डिंग का चयन करने के लिए, सेटअप प्रबंधक मेनू में प्रकाश पथ उपकरण खोलने अधिग्रहण टैब में। वांछित पीएमटी (चेक बॉक्स) को सक्रिय करने और इस चैनल के लिए एक रंग का चयन करें। इस काम में, हरे रंग की कारों, प्रतिदीप्ति और स्वयं सहायता समूह के लिए मैजेंटा के लिए लाल रंग के लिए चुना गया था।

3. अस्थायी तुल्यकालन

नोट: दो लेजर बीम एक ही तिवारी से उत्पन्न: नीलम लेजर बीम लेकिन OPO जब यह उत्पन्न होता है तो दो मुस्कराते हुए समय में सिंक्रनाइज़ नहीं कर रहे हैं, जब वे माइक्रोस्कोप तक पहुंचने देरी हो रही है। यहाँ लक्ष्य दो मुस्कराते हुए एक देरी करने के लिए उन्हें समय में फिर से सिंक्रनाइज़ करने से पहले वे माइक्रोस्कोप तक पहुँचने है।

  1. BNC केबल के साथ बिजली BNC लेजर उत्पादन (सिंक। आउट) को आस्टसीलस्कप के इनपुट चैनल CH1 कनेक्ट करें। इनपुट चैनल photodiode के लिए आस्टसीलस्कप के CH2 कनेक्ट और ट्रिगर मेनू, तो मुख्य मेनू बटन स्रोत और फिर पक्ष मेनू बटन है कि चयनित सी चैनल से मेल खाती है दबाकर ट्रिगर चैनल के रूप में CH1 चैनल चुनएच 1।
  2. स्थिति और उद्देश्य को हटाने के बाद एक हवाई खुर्दबीन उद्देश्य (10X) या माइक्रोस्कोप की किरण पथ में की फोकल हवाई जहाज़ में photodiode ऑप्टिकल बढ़ते पदों के साथ तय कर लो। नोट: यदि आवश्यक हो, कंडेनसर और अपने कैरियर को हटा दें।
  3. चैनल उपकरण (अधिग्रहण पैरामीटर उपकरण समूह) में, तिवारी को परिभाषित: कम बिजली पर 830 एनएम पर नीलम लेजर तरंगदैर्ध्य (यानी, पूरी शक्ति के कम से कम 1%)। अधिग्रहण मोड उपकरण में, क्रम में सबसे नन्हा किरण के साथ photodiode रोशन करने में एक बिंदु के लिए क्षेत्र स्कैन कम। सतत बटन पर क्लिक करके लेजर स्कैन पर स्विच।
  4. आस्टसीलस्कप सामने पैनल पर प्रेस autoset और मैन्युअल photodiode की स्थिति के लिए कदम स्क्रीन पर पल्स गाड़ियों पाने के लिए। प्रेस भागो / बटन बंद प्रदर्शन फ्रीज करने के लिए।
    1. आस्टसीलस्कप प्रदर्शन की एक प्रति बचाने के लिए, एक 3.5 डालनेफ्लॉपी डिस्क ड्राइव में फ्लॉपी डिस्क इंच या एक कंप्यूटर करने के पीछे के पैनल पर GPIB पोर्ट से कनेक्ट। फिर Shift हार्डकॉपी मेनू, प्रेस प्रारूप (मुख्य) झगड़ा छवि प्रारूप का चयन करें और आउटपुट चैनल पोर्ट मेनू में निर्दिष्ट करने के लिए दबाएँ। प्रेस हार्डकॉपी बटन तिवारी की नब्ज ट्रेनों की आस्टसीलस्कप प्रदर्शन रिकॉर्ड करने के लिए: लेजर नीलमणि।
  5. स्टॉप बटन पर क्लिक करके नीलमणि लेजर स्कैन: तिवारी बंद कर दें। चैनल उपकरण पर क्लिक करके 1,107 एनएम और कम बिजली पर OPO संकेत परिभाषित करते हैं। OPO लेजर स्कैन पर स्विच और आस्टसीलस्कप पर OPO लेजर की नब्ज गाड़ियों रिकॉर्ड है। OPO लेजर स्कैन बंद कर दें।
  6. नीलमणि और OPO संकेतों: तिवारी के बीच अस्थायी पारी की तुलना करें।
    नोट: अस्थायी पारी टी पारी विलंब लाइन एल DelayLine जो समीकरण निम्नलिखित लागू किया जाना है की लंबाई देता है: एल delayLine = ग5; टी शिफ्ट जहां सी प्रकाश की गति है।
  7. लेजर लाइनों में से एक का चयन करें।
    नोट: इस काम में, तिवारी: नीलम लेजर लाइन क्योंकि मुक्त अंतरिक्ष इस लेजर लाइन के पास उपलब्ध था चुना गया था। इसके अलावा, इस विकल्प के एक दृश्य लेजर प्रकाश के साथ लेजर लाइन की फिर से संरेखण को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है।
  8. जहां स्थिति विलंब लाइन लागू किया जाएगा पर सुरक्षात्मक नलियों को हटाने के द्वारा लेजर लाइन खोलें।
    सावधानी! उचित सुरक्षा चश्मे पहनें और चेन कंगन हटाने या कलाई से देखते हैं।
  9. आसानी से (सॉफ्टवेयर के चैनल उपकरण में, उदाहरण के लिए 700 एनएम कम बिजली पर) लेजर बीम का पालन करने में सक्षम होना करने के क्रम में दिखाई रेंज में एक तरंग दैर्ध्य का चयन करें। लेजर स्कैन पर स्विच।
  10. जगह और ऑप्टिकल बढ़ते पदों खुला लेजर रेखा के साथ दो आईरिस डायाफ्राम के साथ सेट। स्थिति विलंब लाइन के बाहर निकलने पर एक आईरिस और पेरिस्कोप के प्रवेश द्वार पर अन्य आईरिस जगह है।
    नोट: पीईदो मोटर चालित लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की स्कैनिंग सिर में लेजर बीम के प्रवेश द्वार के कोण सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित होने वाला दर्पण द्वारा riscope नियंत्रित करता है।
  11. आईरिस डायाफ्राम एपर्चर कम होती है और डायाफ्राम पदों को समायोजित लेजर किरण पथ फिट करने के लिए। ऑप्टिकल मेज पर उन्हें ठीक। लेजर बीम की ऊंचाई की जांच करने के लिए क्रमिक स्थिति जबकि विलंब लाइन के चार दर्पण एक तिहाई मोबाइल आईरिस डायाफ्राम के ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करें।
    नोट: ये आईरिस diaphragms मार्ग का अनुसरण करने के लिए दिखा कर फिर से संरेखण प्रक्रिया के लिए नियंत्रण के रूप में काम करेगा।
  12. दर्पण एम 1 एक कॉम्पैक्ट विज्ञान सम्बन्धी दर्पण पर मुहिम शुरू की देरी लाइन के प्रवेश द्वार पर माउंट (जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है) और अपनी स्थिति और मोबाइल आईरिस डायाफ्राम के उपयोग के साथ किरण ऊंचाई बनाए रखने के लिए अपने रुख को समायोजित रखें। प्लेस M2 और एम 3 अनुवाद चरण जो midco पर तैनात किया जाएगा पर 90 डिग्री पर (भी कॉम्पैक्ट विज्ञान सम्बन्धी दर्पण माउंट पर घुड़सवार) दर्पणurse। उन्हें स्थिति के रूप में पहले से गणना की देरी लाइन की लंबाई फिट करने के लिए।
  13. मोबाइल आईरिस डायाफ्राम के उपयोग के साथ M2 और एम 3 के उन्मुखीकरण को समायोजित करें। एम 4 सेट विलंब लाइन के बाहर निकलने पर (यह भी एक कॉम्पैक्ट माउंट पर तय) (बस आईरिस मैं 1 के रूप में पहले चित्र 1 में दिखाया गया है) और ध्यान से दो तय आईरिस डायाफ्राम के माध्यम से लेजर किरण पथ फिट करने के लिए अपनी स्थिति और कोण समायोजित करें।
  14. खुर्दबीन उद्देश्य के उत्पादन में लेजर को देखने कार्ड स्थिति और लेजर स्कैन पर बारी करने के लिए सतत पर क्लिक करके लेजर बीम प्रोफ़ाइल की जाँच करें। एक समान उज्ज्वल डिस्क का निरीक्षण करें। यदि आवश्यक हो, थोड़ा एम 4 के उन्मुखीकरण को समायोजित।
  15. फिर स्थिति माइक्रोस्कोप का नमूना फोकस विमान में लेजर बीम के नीचे तेजी से photodiode। नीलमणि लेजर बीम और आस्टसीलस्कप पर OPO किरण: तिवारी के बीच अस्थायी पारी का निरीक्षण करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, पूरे सिस्टम एम 2 चलती द्वारा देरी लाइन की लंबाई को बदलने, एम 3 पर मुहिम शुरू कीअनुवाद चरण (अनुवाद चरण ट्यूनिंग बदलने के बिना) दोनों दालों सिंक्रनाइज़ करने के लिए। कुछ सेंटीमीटर की परिवर्तन आवश्यक हो सकता है।

4. कड़ियां के स्थानिक ओवरलैप

नोट: एक कार संकेत का उत्पादन करने के लिए, दो लेजर बीम के स्थानिक ओवरलैपिंग की आवश्यकता है। एक ही मोती दो अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ भर में दाग पर दोनों मुस्कराते हुए वैकल्पिक रोशनी स्थानिक पारी इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दर्पण पदों के ठीक समायोजन तो पारी को कम कर सकते हैं।

  1. उपयोग फ्लोरोसेंट microspheres पूर्व मुहिम शुरू की। या साफ खुर्दबीन स्लाइड पर निलंबन में microspheres नीचे वर्णित के रूप में माउंट:
    1. नमूना लेने से पहले, मिश्रण (एक कोर्टेक्स मिक्सर पर या sonicating द्वारा) मोती समाधान सुनिश्चित करें कि मोती समान रूप से निलंबित कर दिया हो।
    2. एक स्लाइड की सतह के लिए मनका निलंबन के 5 μl लागू करें और विंदुक टिप के साथ फैल गया। छोटी बूंद के लिए प्रतीक्षा करने के लिए सूखी और फिर लागू पर्वत के 5 μlऐसे ग्लिसरॉल, पानी या मोती की सूखी नमूना भर में विसर्जन के तेल के रूप में मध्यम हैैं। एक coverslip साथ नमूना कवर और जल्दी सुखाने गोंद या पिघल आयल के साथ coverslip सील।
  2. फ्लोरोसेंट polystyrene मोती 20X पानी उद्देश्य के तहत एक खुर्दबीन स्लाइड पर तय रखें। उद्देश्य विसर्जित करने के लिए पानी की कुछ बूँदें जोड़ें।
  3. मनकों पर ध्यान केंद्रित करने के लक्ष्य को हासिल करने के लिए, आंखों के साथ नमूना के प्रत्यक्ष अवलोकन करने के लिए लेजर स्कैनिंग मोड से स्विच करने के लिए ऑनलाइन बटन दबाने से सॉफ्टवेयर में टैब का पता खुला। तदर्थ फिल्टर का चयन करें और माउस पर क्लिक करके हैलोजन लैंप पर स्विच करने के लिए नेत्र उपकरण को खोलें।
  4. मैन्युअल अनंत अंतरिक्ष में sideport स्लाइडर में dichroic दर्पण को हटाने और माइक्रोस्कोप के ध्यान केंद्रित कर ड्राइव का उपयोग oculars के साथ मोती देख कर नमूना विमान ध्यान दें। dichroic दर्पण बदलें।
  5. मेंटैब जानें, ऑफलाइन बटन दबाने से लेजर स्कैनिंग मोड के लिए स्विच। स्कैनिंग के लिए मानकों को परिभाषित करने के लिए अधिग्रहण टैब पर जाएँ: 512 पिक्सल के लिए फ्रेम आकार, 9 के स्कैन की गति, 1 के एक औसत, 8 बिट के एक बिट गहराई का चयन करें और अधिकतम करने के लिए स्कैन क्षेत्र में वृद्धि।
  6. अधिग्रहण टैब के चैनल उपकरण में एक ट्रैक (ट्रैक 1) पहले से ही नहीं बनाया है, तो जोड़ें। तिवारी के लिए 830 एनएम तरंगदैर्ध्य और कम बिजली की चयन करें:। नीलम लेजर बीम चैनल खिड़की से और PMT3 या प्रकाश पथ खिड़की से PMT4 बॉक्स में 1 ट्रैक बॉक्स में हरे रंग के लिए रंग टिक।
  7. अधिग्रहण टैब के चैनल उपकरण में एक दूसरे ट्रैक (ट्रैक 2) जोड़ें। OPO लेजर बीम के लिए 1,107 एनएम और कम बिजली पर तरंग दैर्ध्य का चयन करें। चैनल खिड़की से और से PMT3 बॉक्स में ट्रैक 2 बॉक्स में लाल रंग टिक
  8. तो फिर 600 के लिए दोनों पटरियों के लाभ को समायोजित, क्रमिक रूप से सतत पर क्लिक करके नमूना पर दो मुस्कराते हुए स्कैन लागू होते हैं।
  9. 2 डी देखने में स्क्रीन क्षेत्र में छवि का निरीक्षण करें। प्रदर्शन को देखने के विकल्प को नियंत्रित ब्लॉक में, प्रदर्शन तीव्रता को समायोजित।
    नोट: यदि आवश्यक हो, थोड़ा मोतियों का ध्यान केंद्रित विमान को खोजने के लिए ध्यान केंद्रित कर ड्राइव ले जाते हैं। फसल को समायोजित करें और एक एकल मनका में या आसन्न मोती के एक समूह में छवि ज़ूम।
  10. XY विमान में मुस्कराते हुए ओवरलैप करने के लिए पेरिस्कोप नियंत्रक का प्रयोग करें। सॉफ्टवेयर में, बनाए रखें टैब खुला। प्रणाली विकल्प पर क्लिक करें और मोटर चालित पेरिस्कोप उपकरण विंडो प्रदर्शित करते हैं। आदेश में नीलम लेजर बीम अंतरिक्ष में दोनों छवियों सिंक्रनाइज़ करने के लिए: तिवारी की पेरिस्कोप दर्पण के मोटे और ठीक समायोजन का उपयोग करें।
  11. पेरिस्कोप में गड़बड़ी के लिए, ऊर्ध्वाधर और Seco के लिए पहली समायोजन सलाखों का उपयोगलेजर बीम की क्षैतिज आंदोलनों के लिए एन डी एक। जब तक छवि थोड़ा दिख रहा है इनपुट दर्पण के साथ किरण ले जाएँ, और उसके बाद "इनपुट" और "उत्पादन" पर क्लिक करके पेरिस्कोप के उत्पादन में दर्पण के साथ लेजर तीव्रता के लिए क्षतिपूर्ति।
  12. नीलमणि लेजर बीम: आदेश में खड़ी, मुस्कराते हुए ओवरलैप, को बनाए रखने टैब में Collimator उपकरण खोलने और तिवारी की फोकल दूरी के मूल्य को समायोजित करने के लिए।
  13. धीरे दोनों छवियों पर ध्यान केंद्रित करने के अंतर की जाँच करने के उद्देश्य ऊर्ध्वाधर स्थिति में ले जाएँ। या, अधिग्रहण टैब जेड ढेर उपकरण में उद्घाटन से नमूने के एक Z ढेर ले और विभिन्न मापदंडों (रेंज, स्लाइस की संख्या) का चयन करें। छवि स्क्रीन क्षेत्र में प्रेस ऑर्थो अक्षीय पार अनुभाग में मुस्कराते हुए देखते हैं। उसी प्रक्रिया में कई बार ऐसा करने से जेड ओवरलैप को अधिकतम।

5. अंतिम समायोजन और सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (कार) जैतून का तेल डॉ से सिग्नल अवलोकनoplets

  1. एक गिलास प्लेट पर जैतून का तेल की एक छोटी बूंद रखो और इसे एक गिलास को कवर पर्ची द्वारा कवर किया। एक 20X पानी विसर्जन उद्देश्य विसर्जित करने के लिए पानी की कुछ बूँदें जोड़ें। oculars का उपयोग करके कवर पर्ची के किनारे पर फोकस (के रूप में 4.2 में पहले से समझाया)।
  2. नीलमणि लेजर बीम और OPO के लिए 1,107 एनएम पर: अधिग्रहण टैब के चैनल उपकरण में 1 ट्रैक तिवारी के लिए 830 एनएम तरंगदैर्ध्य का चयन करें। 1 ट्रैक में दोनों लेज़रों टिक दोनों लेज़रों के एक साथ स्कैन पाने के लिए। एक शुरुआत के लिए कम मूल्य पर सेट शक्तियों।
  3. प्रकाश पथ विंडो में, PMT1 का चयन करें। सतत बटन पर क्लिक करके लेजर स्कैन पर स्विच। तेल पतली परत में लेजर प्रकाश देने के लिए थोड़ा ध्यान ले जाएँ।
  4. यदि आवश्यक हो, दोनों लेज़रों के ऑप्टिकल शक्ति में वृद्धि। प्रदर्शन को देखने के विकल्प को नियंत्रित ब्लॉक में प्रदर्शन तीव्रता को समायोजित करें। धीरे-धीरे विलंब लाइन का अनुवाद चरण के लिए कदम तक संकेत हस्ताक्षर हो जाता हैnificantly बढ़ाया।
  5. बाद ठीक संरेखण पूरा कर रहे हैं, की जाँच करें कि क्या यह सच है एक कार संकेत: थोड़ा कदम अनुवाद चरण; संकेत की तीव्रता कमजोर हो जाना चाहिए। और / या बंद लेजर बीम से एक स्विच, या तो तिवारी: नीलम लेजर या OPO। फिर वहाँ कारों की तुलना में संकेत तीव्रता में एक मजबूत क्षय होना चाहिए।
  6. अधिकतम कारों संकेत प्राप्त करने के लिए, सॉफ्टवेयर पर विकल्प का चयन पूरी छवि का मतलब तीव्रता का एक मूल्य प्रदान करने के लिए (स्क्रीन क्षेत्र टैब की histo ध्यान में रखते हुए)। तरंगदैर्ध्य (कुछ एनएम) समायोजित करें, तो एक्स, वाई, जेड फोकस किरण के पदों मतलब तीव्रता मूल्य को अधिकतम करने के लिए।

6. विलंब लाइन का प्रकाश पथ के बाड़े

  1. चूंकि अंतिम प्रणाली गैर भौतिक विज्ञानियों के लिए समर्पित है, ट्यूब या एक बाड़े बॉक्स के साथ विलंब लाइन का प्रकाश पथ लगा देना, हानिकारक गैर दृश्य उच्च शिखर शक्ति लेजर बीम के लिए सीधी पहुँच से बचने के लिए। अनुवाद चरण के लिए एक पहुँच प्रदान करने के ख्याल रखनाघुंडी।

7. कारों के लिए ट्यूनिंग वेवलेंथ

  1. समीकरण का उपयोग 1 समीकरण धुन करने के लिए वांछित रमन कंपन करने के लिए लेजर तरंग दैर्ध्य। नीलमणि = 830 एनएम और λ OPO = 1,095 एनएम: छवि कारों के लिए इस काम में प्रस्तुत परिणाम प्रतिलिपि 3015 सेमी -1, तिवारी λ चयन कंपन खींच होने सीएच बांड से संकेत।
    नोट:।। रमन विशेषता कंपन जैसे पानी जैविक नमूने, में मनाया आवृत्तियों, सीएच बांड एट अल इवांस 13 में या एलिस एट अल 29 में पाया जा सकता है।
  2. समीकरण का उपयोग 2 समीकरण कारों संकेत के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करने के लिए। कारों से सीएच बांड इमेजिंग के लिए, λ कारों के बाद से 670 एनएम पर एक संकीर्ण बैंड फिल्टर का चयन = लेजर तरंग दैर्ध्य के साथ 670 एनएम 7.1 में प्रस्तुत किया।
    नोट: एक मोबाइल फोन आवेदन ए.वी. हैसे λ कारों की गणना करने के ailable λ λ पी और एस मूल्यों (संदर्भ 30 देखें)।

Sciatic तंत्रिका कटौती से कारों सिग्नल और दाग माइलिन का अवलोकन 8.

नोट: सभी पशु प्रयोगों संस्थागत नियमों के अनुसार आयोजित की गई।

  1. के रूप में OZCELIK एट अल। 31 में प्रस्तुत एक खुर्दबीन स्लाइड पर अक्षीय और अनुदैर्ध्य sciatic तंत्रिका कटौती तैयार करें।
  2. पीबीएस में शेयर समाधान 300 गुना कमजोर द्वारा fluoromyelin लाल धुंधला समाधान तैयार है। आरटी पर 20 मिनट के लिए धुंधला समाधान के साथ तंत्रिका कटौती बाढ़। समाधान निकालें और पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
  3. 20X पानी विसर्जन उद्देश्य के तहत कटौती की स्थिति। एक coverslip रखें। पीबीएस की कुछ बूंदों के उद्देश्य को विसर्जित कर दिया और oculars के माध्यम से कटौती की एक साफ छवि प्राप्त करने के लिए (जैसा कि पहले 4.2 में विस्तृत) उद्देश्य का ध्यान समायोजित करने के लिए जोड़ें।
    4. <ली> ट्रैक 1 में, तिवारी का चयन करें: नीलम और OPO लेजर और क्रमश: 830 एनएम और 1,095 एनएम के लिए उनकी तरंग दैर्ध्य को परिभाषित। प्रकाश पथ विंडो में, PMT1 और हरे रंग का चयन करें।
  4. ट्रैक 2 में, OPO लेजर केवल (1,095 एनएम तरंगदैर्ध्य) का चयन करें। प्रकाश पथ विंडो में, PMT4 और लाल रंग का चयन करें।
  5. दोनों लेज़रों के लिए, कम शक्ति का चयन करें और एक शुरुआत के लिए 600 लाभ निर्धारित किया है। लेजर स्कैन पर स्विच और कारों में सुधार करने के लिए निम्नलिखित मानकों को समायोजित करने और प्रतिदीप्ति संकेत विरोधाभासों: बिजली मूल्यों, अनुवाद चरण घुंडी (बहुत थोड़ा), तरंग दैर्ध्य (कुछ एनएम), प्रदर्शन तीव्रता।
  6. उच्च संकल्प पर अंतिम छवियों रिकॉर्ड करने के लिए, निम्नलिखित मानकों अधिग्रहण मोड उपकरण में चयन: 1024 पिक्सल के फ्रेम आकार, 7 की स्कैन की गति, 4. एक एकल छवि रिकॉर्डिंग के लिए स्नैप बटन पर क्लिक करें की औसत। मालिकाना रूप में छवि को बचानेपर छवि और पूर्ण अधिग्रहण पैरामीटर रिकॉर्ड करने के लिए।

Sciatic तंत्रिका कटौती से कारों और एसएचजी सिग्नल 9. अवलोकन

  1. के रूप में OZCELIK एट अल। 31 में प्रस्तुत sciatic तंत्रिका तैयार करें।
  2. के रूप में भाग 8 में समझाया oculars के माध्यम से एक छवि को पाने के लिए और कारों संकेत पैरामीटर (1 ट्रैक) का चयन करने के लिए प्रक्रिया का पालन करें।
  3. ट्रैक 2 में, OPO लेजर केवल (1095 एनएम तरंगदैर्ध्य) का चयन करें। प्रकाश पथ विंडो में, PMT3 और मैजेंटा रंग का चयन करें।
  4. के रूप में भाग 8 में समझाया लेजर स्कैन पर स्विच और उच्च संकल्प छवियों को बचाने के लिए प्रक्रिया का पालन करें।

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Representative Results

मानक तिवारी की नब्ज ट्रेन आवृत्ति: नीलम लेजर आम तौर पर लगभग 80 मेगाहर्ट्ज है। लेजर नीलमणि: OPO एक ही आवृत्ति के बाद से यह तिवारी से पंप किया जाता है। कम से कम 200 मेगाहर्ट्ज के एक तेजी से आस्टसीलस्कप इसलिए आवश्यक है। रेंज में एक तेजी से photodiode 600 1100 एनएम भी आवश्यक है। अधिक से अधिक अस्थायी पारी तब होता है जब तिवारी: नीलम और OPO संकेतों 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6.2 nanoseconds के लिए स्थानांतरित कर दिया जाता है। यह 1.9 मीटर की अधिकतम किरण पथ पारी से मेल खाती है चित्रा 2 OPO लेजर बीम (ए) से दर्ज पल्स ट्रेन से पता चलता है और तिवारी से:। (विलंब लाइन (बी) के बिना नीलमणि लेजर बीम और समायोजित विलंब लाइन के साथ सी )। पल्स ट्रेनों इस प्रकार मोटे तौर पर लागू किया विलंब लाइन के साथ समय में सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं के रूप में चित्रा 2A और -2 में दिखाया गया है।

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OPO किरण (ए) के एक 10x उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप नमूना विमान पर अस्थायी तुल्यकालन के लिए चित्रा 2. लेजर पल्स ट्रेन रिकॉर्डिंग नाड़ी गाड़ियों की रिकॉर्डिंग, तिवारी:। के बिना (बी) नीलमणि लेजर बीम और देरी लाइन के साथ (सी )। प्रत्येक ग्राफ भूखंडों संकेत सीधे तिवारी की पीठ पर bnc कनेक्टर से दर्ज की शीर्ष वक्र: नीलम लेजर (सिंक बाहर कनेक्टर।)। आस्टसीलस्कप ट्रिगर इस संकेत पर निकाला जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दो मुस्कराते हुए स्थानिक ओवरलैप फ्लोरोसेंट polystyrene मोती एक खुर्दबीन स्लाइड (चित्रा 3 ए) के शीर्ष पर तय की दृश्य द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 3 बी तीन पास के मोतियों की छवि द्वारा दिए गए पता चलता है1,107 एनएम (लाल रंग झूठी) और OPO लेजर तिवारी द्वारा: 830 एनएम पर नीलम लेजर (हरे रंग झूठी)। दोनों लेजर बीम के बीच स्थानिक पारी स्थानिक तुल्यकालन पहले से वर्णित (चित्रा -3 सी) की प्रक्रिया के बाद मुआवजा दिया जा चुका है।

चित्र तीन
चित्रा 3. मुस्कराते हुए स्थानिक ओवरलैप। फ्लोरोसेंट microspheres (ए) का सामान्य दृश्य। 3 आसन्न microspheres पर ज़ूम। 830 और 1,107 पर मोतियों की रोशनी एनएम एक स्थानिक (बी) मनका छवियों की पारी (झूठी रंग) से पता चलता है। एक्स, वाई, जेड समायोजन के बाद, मनका छवियों विलय कर रहे हैं (सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अंतिमकारों को सक्रिय करने के लिए सटीक अस्थायी समायोजन प्राप्त करने के लिए कदम आसानी से इमेजिंग जैतून का तेल बूँदें (कई सीएच बांड 32 से युक्त) द्वारा और दोनों लेजर पल्स ट्रेनों के समय में तुल्यकालन पूरा करने के लिए विलंब लाइन का थोड़ा दर्पण ले जाकर महसूस किया जा सकता है। चित्रा 4 OPO रोशनी केवल (चित्रा 4 बी) से नीलम लेजर रोशनी केवल (चित्रा 4 ए) और: तिवारी से दिया एक जैतून का तेल छोटी बूंद के चित्रों से पता चलता। 3100 सेमी -1 - दोनों मुस्कराते हुए एक साथ लागू किया 670 एनएम, जो मेल खाती है एक कार आंतरिक कार्बन-हाइड्रोजन (स्विस) के चारों ओर 2,800 रमन कंपन सीमा के साथ कंपन खींच से संकेत पर एक स्पष्ट संकेत वृद्धि (चित्रा 4C) प्रेरित। कारों संकेत (सी) गायब हो जाता है जब एक से दो मुस्कराते हुए बंद है। चूंकि जैतून का तेल प्राकृतिक fluorophores 33, रेंज में उत्सर्जन 650 विशेष क्लोरोफिल अणु में शामिल हैं - 670 एनएम, (ए) और (बी) में कमजोर संकेत एक एमयूएल हैtiphoton प्रतिदीप्ति प्रक्रिया। इन संकेतों की तीव्रता परिमाण कारों की तुलना में कम संकेत के कई आदेशों है। इसलिए, यह कारों के संकेत के माप उपद्रव नहीं है।

चित्रा 4
चित्रा 4 कारों के लिए अंतिम ठीक अस्थायी समायोजन फैलने का संकेत। जैतून का तेल बूंदों माइक्रोमीटर ड्राइव के साथ रैखिक अनुवाद चरण के साथ देरी लाइन की लंबाई का समायोजन करके दोनों मुस्कराते हुए समय में धुन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (ए) 830 एनएम लेजर प्रकाश केवल और तहत बूंदों (बी) के 1,107 एनएम लेजर प्रकाश केवल एक कमजोर संकेत दिखा। एक साथ रोशनी (सी) के तहत स्पष्ट संकेत वृद्धि मनाया जाता है, कारों संकेत करने के लिए इसी। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। 3,015 सेमी में रमन कंपन चोटी -1। उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

माइलिन आवरण एक जैविक संरचना विशिष्ट कोशिकाओं है कि चादर और मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली 34 में न्यूरॉन्स की एक्सोन के चारों ओर अपने प्लाज्मा झिल्ली घनीभूत द्वारा निर्मित है। इस म्यान अत्यधिक अलग लिपिड में समृद्ध है। हम यहाँ एक माउस के sciatic तंत्रिका की मेलिन शीथ इस्तेमाल किया। आड़ा और अनुदैर्ध्य sciatic तंत्रिका पार अनुभाग खंडों 1,095 एनएम पर माइलिन के दो photon प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए दाग दिया है के रूप में चित्रा 5 ब और चित्रा 5E में दिखाया गया है, क्रमशः। एक fluoromyelin लाल रंग है, जो माइलिन के लिए चयनात्मकता है 35 का इस्तेमाल किया गया था। इन नमूनों को एक साथ 830 पर और 1,095 एनएम पर प्रबुद्ध किया गया है और कारों संकेत (चित्रा 5 ए और चित्रा 5 डी) मनाया गया। चित्रा 5 ए-सी में, हलकों एक्सोन के आसपास मेलिन शीथ के अनुरूप (में खाली जगहआड़ा कटौती में छल्ले) की ओर। जैसा कि चित्र 5C और 5F में दिखाया गया है, एक ही संरचना कारों और प्रतिदीप्ति छवियों ओवरलैपिंग जबकि पाया जाता है। हम निष्कर्ष है कि विवरण के समान स्तर कारों के साथ है और इसलिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग के उपयोग के बिना प्राप्त किया जा सकता है।

चित्रा 5
चित्रा 5. कारों और sciatic तंत्रिका कटौती के दाग माइलिन इमेजिंग। (ए) आड़ा और (डी) लेबल मुक्त कारों मेलिन शीथ की इमेजिंग के अनुदैर्ध्य कटौती। (बी) आड़ा और (ई) एक ही नमूना 1,095 एनएम पर दो photon प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत fluoromyelin लाल रंग से दाग के अनुदैर्ध्य कटौती। दोनों छवियों (सी) आड़ा और (एफ) अनुदैर्ध्य काट ओवरलैप। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन कर रहे हैं। औसत ऑप्टिकल शक्तियों 830 एनएम और 16 में 5 मेगावाट थेकारों संकेत के लिए 1,095 मेगावाट एनएम पर। औसत ऑप्टिकल शक्ति दो photon प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए 1,095 एनएम पर 8 मेगावाट थी। 2,915 सेमी -1 पर रमन कंपन शिखर। कारों संकेत एक लेजर स्कैन रोकने के द्वारा या रमन गूंज से बाहर अनुवाद चरण ले जाकर गायब हो जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके अतिरिक्त कारों इमेजिंग के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोपी प्रणाली एक साथ sciatic नसों की बाहरी सतह पर कोलेजन फाइबर से दूसरे हार्मोनिक उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है। इस अतिरिक्त छवि केवल 550 एनएम (OPO के आधे तरंगदैर्ध्य) 670 एनएम कारों संकेत रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है पर एक संकीर्ण बैंड पास फिल्टर के बाद से एक संकेत रिकॉर्ड करने के लिए एक अलग डिटेक्टर के उपयोग की आवश्यकता है। चित्रा 6 एक विपरीत छवि को दर्शाता है झूठी हरे रंग में दिखाया गया मेलिन शीथ की (कारों पर संकेतचित्रा 6A) झूठी मैजेंटा रंग में सचित्र कोलेजन फाइबर से घिरा में Ly (केवल चित्रा 6B में एसएचजी)। कारों संकेत औसत ऑप्टिकल 1,095 एनएम पर 13 मेगावाट 830 एनएम पर 4 मेगावाट की शक्तियों और साथ हासिल की थी, जबकि यह 1,095 एनएम पर 50 मेगावाट की आवश्यकता एसएचजी संकेत प्राप्त करने के लिए। इसलिए बहुत कम ऑप्टिकल ऊर्जा कारों प्राप्त करने के लिए आवश्यक है एसएचजी या THG () नहीं दिखाया हमारे जैविक नमूने में संकेतों की तुलना में संकेत।

चित्रा 6
चित्रा 6 कारों और माउस sciatic तंत्रिका के एसएचजी इमेजिंग। (ए) कारों इमेजिंग, (बी) एसएचजी इमेजिंग और (सी) एक साथ माइलिन की इमेजिंग (हरे रंग में झूठी) कारों द्वारा स्वयं सहायता समूह इमेजिंग (मजेंटा में) द्वारा दृश्य और कोलेजन की माउस sciatic तंत्रिका पर। औसत ऑप्टिकल शक्तियों 830 एनएम पर 4 मेगावाट और कारों के लिए 1,095 एनएम पर 13 मेगावाट थे। औसत ऑप्टिकल शक्ति 50 1,095 मेगावाट थी परस्वयं सहायता समूह के लिए एनएम। स्केल बार 10 माइक्रोन है। रमन कंपन 2,915 सेमी में चोटी -1। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

काम की सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा लेजर बीम के अस्थायी तुल्यकालन है। यह एक तेजी से एक तेजी से आस्टसीलस्कप के साथ संयुक्त photodiode आवश्यकता है, लेकिन कुछ ही समय में किसी न किसी ओवरलैपिंग पहली बार में किया जा सकता है। फिर कुछ सेमी का एक और समायोजन की आवश्यकता है। अंत में, एक रेखीय अनुवाद मंच द्वारा माइक्रोमीटर चाल आदेश कारों संकेत को गति प्रदान करने में देरी लाइन की लंबाई के अंतिम ठीक समायोजन प्रदर्शन की अनुमति देता। के रूप में अनुवाद चरण माइक्रोमीटर ड्राइव ट्यूनिंग द्वारा मनाया यह संकेत, करीब 20 माइक्रोमीटर की एक सीमित दायरे में बनाए रखा है। यह पल्स अवधि का लगभग आधा है, यानी, 140 FSEC की कड़ियां की एक चोटी पारी से मेल खाती है। दो मुस्कराते हुए जो कारों के संकेत के लिए आवश्यक है के स्थानिक ओवरलैपिंग ऐसी लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए एक सामान्य बीम संरेखण के समान है।

विलंब लाइन के कार्यान्वयन के प्रयोग में एक बुनियादी पृष्ठभूमि वाले जीव द्वारा कुछ हफ्तों में प्राप्त किया जा सकताअल प्रकाशिकी या सहयोग में भौतिकविदों के साथ। विशेष देखभाल दर्पण के चुनाव प्रतिबिंब घाटे को कम करने के लिए लिया जाना है। तो सामग्री के बहुमत विलंब लाइन के निर्माण के लिए सस्ती है, आस्टसीलस्कप जो आवश्यक है एक मानक आस्टसीलस्कप नहीं है। इस प्रकार, के बाद से कुछ दिनों के अस्थायी तुल्यकालन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, एक जिस्मानी प्रयोगशाला से आस्टसीलस्कप उधार लेने के लिए पर्याप्त हैं सबसे अच्छा विकल्प प्रतीत होता है। स्थानिक ओवरलैपिंग समय लगता है, क्योंकि यह कई दर्पण और लेंस (लेजर स्कैनिंग सिस्टम के आधार पर जो मोटर चालित जा सकता है) की ट्यूनिंग की मांग हो सकती है। पहले कारों लेजर प्रणाली के दो इलेक्ट्रॉनिक रूप से सिंक्रनाइज़ तिवारी के आधार पर: नीलम लेजर लंबी अवधि (घंटे मिनट के दसियों) लौकिक पल्स ओवरलैपिंग के साथ एक मुद्दा था। यह समस्या पूरी तरह से एक अद्वितीय लेजर स्रोत 20,21 के साथ पंप OPO के साथ हल किया गया है। इस तरह के एक लेजर प्रणाली, और मजबूती से clamped प्रकाशिकी का उपयोग के साथ, पंप और स्टोक्स के बीच कोई लौकिक चलना बंद में मनाया गया था मुस्कराते हुएआपरेशन के महीने।

कारों तकनीक का एक प्रमुख सीमा है कि कारों संकेत गुंजयमान अणुओं की उपस्थिति 11 (विलायक या scatterers से) के बिना हो सकता है। इस गैर गुंजयमान पृष्ठभूमि संवेदनशीलता सीमित कर सकते हैं। , लेजर विशेषताओं (femtosecond या पीकोसैकन्ड), उद्देश्य या छवि उपचार विसर्जित करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान के चुनाव तरीके से इस पृष्ठभूमि को कम करने का पता लगाने (आगे या पीछे का पता लगाने) के विन्यास में शामिल हैं। एक पिछड़े पता लगाने न सुनाई देती पृष्ठभूमि 11 को कम करने के रूप में यह इस काम (चित्रा 1) में इस्तेमाल किया गया था की अनुमति देता है। गुजरने तिवारी: नीलम लेज़रों उच्च शिखर तीव्रता गैर रेखीय ऑप्टिकल प्रक्रियाओं के लिए अति आवश्यक हैं। हालांकि, वर्णक्रमीय डोमेन, सबसे रमन लाइनों की चौड़ाई एक femtosecond नाड़ी की वर्णक्रमीय चौड़ाई से छोटी है, जबकि यह एक पीकोसैकन्ड नाड़ी की वर्णक्रमीय चौड़ाई फिट बैठता है। इसलिए पीकोसैकन्ड लेज़र के उपयोग के अनुपात ओ बढ़ जाती हैन सुनाई देती पृष्ठभूमि करने के लिए एफ गुंजयमान संकेत। बांड के उच्च घनत्व की वजह से लिपिड में सीएच बांड, के लिए, न सुनाई देती पृष्ठभूमि एक femtosecond लेजर के लिए नगण्य है। पृष्ठभूमि प्रभाव को कम करने के लिए, बंद गुंजयमान के तहत दर्ज एक संदर्भ छवि के घटाव भी लागू किया जा सकता है (इस काम के लिए नहीं किया जाता है)।

लगभग अवरक्त लेजर बीम के ऊतकों में गहरी पैठ की अनुमति के उपयोग के बावजूद (200 - 300 माइक्रोन), व्यावहारिक प्रवेश गहराई तंत्रिका इमेजिंग में प्राप्त इस काम में किए गए प्रयोगों के साथ लगभग 50 माइक्रोन था। हालांकि इस पैरामीटर imaged जैविक ऊतक की भारी निर्भर है और, क्योंकि सभी myelinated फाइबर गठबंधन और एक छोटे से अंतरिक्ष में केंद्रित कर रहे हैं, परिधीय नसों शायद इस प्रकाश पैठ के मूल्यांकन के लिए सबसे अच्छा नमूने का गठन नहीं है। इसके अलावा, कुछ सेकंड के उच्च संकल्प छवियों (1024 × 1024 पिक्सल) है, जो इन विवो के दृश्य सीमित कर सकते हैं रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक हैं

कारों माइक्रोस्कोपी एक संकल्प विवर्तन सीमा के करीब के साथ रासायनिक विशिष्ट चयनात्मक इमेजिंग की अनुमति देता है। इस तकनीक को किसी भी लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है, और तिवारी के बाद से: नीलम लेजर 700 से 1000 एनएम और OPO लेजर 1,100 से 1,300 एनएम के लिए ट्यून करने योग्य है, यह पूरे स्पेक्ट्रम 500 7000 सेमी से (जैविक प्रणालियों में आणविक कंपन के क्षेत्र को शामिल किया -1)। इस प्रकार, यह लागू है और बहुत ही डीएनए, प्रोटीन, लिपिड, या पानी के लिए विशेषक है, जबकि मजबूत संकेत लिपिड सीएच खींच बंधन से उठता है। Photodamage भी कारों संकेत उत्पन्न करने के लिए दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी इमेजिंग की तुलना में इस्तेमाल किया लेजर शक्ति का स्तर कम होने के कारण कम हो जाता है। के बाद से कारों इमेजिंग कम लेजर शक्ति के साथ और आक्रामक टैग के बिना महसूस किया जा सकता है, यह इसलिए इन विवो अध्ययन के लिए पसंद का एक उपकरण है।

लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप वाईएक femtosecond तिवारी वें: नीलम लेजर एक OPO के साथ संयुक्त स्रोत कई जैविक प्रयोगशालाओं में दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए बड़े पैमाने पर उपलब्ध हो गए हैं। चूंकि स्थानिक तुल्यकालन पहले से ही इन प्रणालियों में कार्यान्वित किया जाता है, इस काम में वर्णित दो मुस्कराते हुए अस्थायी ओवरलैपिंग प्रक्रिया महंगा अतिरिक्त उपकरणों के बिना माइक्रोस्कोपी का अतिरिक्त तकनीक लाता है। इस प्रकार, संशोधित सेट-अप की कोशिकाओं के साथ इमेजिंग या दूसरे या तीसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी, THG), दो photon प्रतिदीप्ति और कारों के साथ रहने वाले ऊतक के लिए अनुमति देता है। कारों तकनीक dynamical प्रक्रियाओं का अध्ययन (दाग या आनुवंशिक जोड़तोड़ के बिना) की अनुमति के जीवित पशुओं के vivo इमेजिंग के लिए महान क्षमता का प्रदर्शन किया है। होनहार आवेदन विवो लेबल मुक्त गैर इनवेसिव लिपिड इमेजिंग, लाइव रीढ़ की हड्डी के ऊतकों 36 में neuronal माइलिन, लिपिड से संबंधित बीमारियों के अध्ययन के लिए (मोटापे की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया, demyelinating और cardiov में शामिलascular रोगों) 37, मानव त्वचा पैठ तंत्र 22 या त्वचा रोग 38। हम मानते हैं कि भविष्य में सुधार इस तरह मुस्कुरा सूक्ष्म उद्देश्यों या लघु उद्देश्य के रूप में विशेष उद्देश्य लेंस, का उपयोग चिंता होगी कारों संकेत के प्रवेश गहराई बढ़ाने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oscilloscope Tektronix TDS 520D 500 MHz 
Photodetector Thorlabs DET08C/M, T4290 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP Carl Zeiss
Motorized periscope Newport
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 Carl Zeiss
Beam combiner Carl Zeiss
Acousto-optic modulator Carl Zeiss
OPO power attenuator Carl Zeiss
Photomultiplier tube Carl Zeiss
ZEN software Carl Zeiss
Bandpass filters Carl Zeiss LSM BiG 1935-176 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm
Dichroic mirror Carl Zeiss Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors Newport 10D20ER.2  λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer Thorlabs PT1/M Quantity 1
Aluminium breadboard Thorlabs MB1015/M  Quantity 1
Mirror mount Thorlabs KMSS/M  Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics  Thorlabs MH25 Quantity 4
Iris diaphragms  Thorlabs ID8/M Quantity 3
Protective box Thorlabs TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S Quantity 1
Optical posts Thorlabs TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661 - 690 nm bandpass filter Semrock 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter Quantity 1
Fluorescent beads ThermoFisher TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card Thorlabs IR laser viewing card
Laser safety glass Newport LV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain  ThermoFisher F34652

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References

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नीलम और OPO लेजर आधारित मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप: तिवारी पर एक सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (कार) प्रणाली के कार्यान्वयन
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Mytskaniuk, V., Bardin, F.,… More

Mytskaniuk, V., Bardin, F., Boukhaddaoui, H., Rigneault, H., Tricaud, N. Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope. J. Vis. Exp. (113), e54262, doi:10.3791/54262 (2016).

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