The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.
The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.
Granulocyte और monocyte phagocytosis / ऑक्सीडेटिव फट (ओ) गतिविधि परख एक सरल, सीधे आगे की तकनीक है कि अक्सर लंबे समय तक और गहन व्यायाम के बाद सहज प्रतिरक्षा समारोह के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जब 1-4 करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया का अध्ययन एक प्रोत्साहन, granulocytes और monocytes क्योंकि वे मेजबान बचाव में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और संक्रमण के स्थल पर जमा करने के पहले प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं विशेष रुचि के हैं। 5 न्यूट्रोफिल, granulocyte का एक प्रकार है, क्षतिग्रस्त मांसपेशियों में सरकाना करने के लिए पहली कोशिकाओं रहे हैं ऊतक गहन व्यायाम के बाद। 6 phagocytosis और ओबी गतिविधि granulocyte और monocyte समारोह, 7 की सबसे आम उपाय कर रहे हैं और दोनों के संक्रमण की प्रक्रिया और मरम्मत की प्रक्रिया में उनकी केंद्रीय भूमिका की वजह से सहज प्रतिरक्षा सेल समारोह के संकेतक के रूप में पसंद कर रहे हैं।
परख इस पांडुलिपि utili में वर्णितमाहिर एक मूल प्रवाह कोशिकामापी granulocyte और monocyte phagocytosis और पूरे रक्त में ओबी गतिविधि का एक मात्रात्मक निर्धारण प्रदान करते हैं। इस तकनीक में पूरे रक्त का उपयोग फायदेमंद है क्योंकि यह अनुमति देता है परख एक समय लेने वाली प्रक्रिया शुद्धि के बिना ही किया जा सकता। इस परख आसानी से अनुसंधान डिजाइन और प्रयोगशाला क्षमताओं की एक किस्म को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लियाओ एट अल। इसी तरह की एक तकनीक है कि न्यूट्रोफिल ओबी गतिविधि को दिखाने के लिए उपयोग किया वृद्धि हुई है और न्यूट्रोफिल phagocytosis कमी आई है घाव मस्तिष्क की चोट के बाद। 8 अन्य उदाहरण में, McFarlin एट अल। इस तकनीक allophycocyanin का उपयोग करता है की एक सुंदर संशोधन (एपीसी वर्णित ) छवि के आधार से फ्लो उनकी phagocytosis और ओबी गतिविधियों के संदर्भ में granulocytes वर्गीकृत करने के साथ CD66b और उच्च प्रदर्शन मिलकर एपीसी संयुग्मित CD45 लेबलिंग संयुग्मित। 7,9
हमारे शोध समूह इस ते के विभिन्न रूपांतरों इस्तेमाल किया गया हैलगभग 20 वर्षों के लिए, अधिक वजन मोटापे से ग्रस्त हैं, और पुष्ट आबादी में सहज प्रतिरक्षा समारोह का एक संकेतक के रूप में chnique। 10,11 पाठ नीचे इस परख प्रदर्शन के लिए कदम दर कदम निर्देश के साथ पाठक प्रदान और क्षेत्रों है कि पाठक के लिए अनुकूल हो सकते हैं पर प्रकाश डाला जाएगा उनके अनुसंधान की जरूरतों को पूरा करने के लिए।
यह पांडुलिपि granulocyte और monocyte समारोह के दो संकेतक के निर्धारण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है। हम कुछ कदम है कि इस परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं की पहचान की है। ऐसा ही एक कदम बर्फ स्नान ऊष्मा…
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस प्रक्रिया के अनुकूलन के दौरान उनकी सहायता के लिए जैक Shue, केसी जॉन, और लिन Cialdella-Kam स्वीकार करना चाहते हैं।
12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
PBS (10X), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample. |
4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
200 µL extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |