Summary

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

Published: September 12, 2016
doi:

Summary

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Abstract

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

Introduction

Phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים / פרץ חמצוני (OB) assay פעילות היא טכניקה פשוטה, ישר קדימה אשר משמש לעתים קרובות כדי לאסוף מידע על תפקוד מערכת החיסון המולדת לאחר פעילות גופנית ממושכת ואינטנסיבית. 1-4 כאשר לומדים את התגובה של המערכת החיסונית גירוי, גרנולוציטים ומונוציטים הם בעלי העניין מיוחד משום שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהגנת מארח הם תאי החיסון הראשונים לצבור באתר של זיהום. 5 נויטרופילים, סוג של גרנולוציט, הם התאים הראשונים כדי translocate לתוך שריר ניזוק רקמות לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית. 6 Phagocytosis ופעילות OB הם האמצעים הנפוצים ביותר של פונקצית גרנולוציט ו מונוציטים, 7 והם העדיפו כאינדיקטורים תפקוד תא חיסון מולד בגלל תפקידם המרכזי בשניית תהליך ההדבקה ואת תהליך התיקון.

Assay המתואר ב utili כתב היד הזהzes זרימה בסיסית cytometer לספק קביעה כמותית של גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB בדם כולו. השימוש של דם מלא בטכניקה זו יש יתרון משום שהוא מאפשר assay להתנהל ללא הליך טיהור גוזל זמן. assay זה יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים מגוון של עיצובי מחקר ויכולות מעבדה. לדוגמה, ליאו et al. מנוצל בטכניקה דומה כדי להראות פעילות OB נויטרופילים הוא גדל phagocytosis נויטרופילים הוא ירד בעקבות פגיעה מוחית טראומטית. 8 בדוגמה נוספת, McFarlin et al. תיאר שינוי אלגנטי של טכניקה זו המשתמשת allophycocyanin (APC ), מצומדות CD66b וסימון CD45 APC מצומדות טנדם בעל ביצועים גבוהים עם cytometry זרימה מבוסס תמונה לסווג גרנולוציטים מבחינת פעילויות phagocytosis ו OB שלהם. 7,9

קבוצת המחקר שלנו השתמשה עיבודים שונים של טה זוchnique כאינדיקטור תפקוד מערכת החיסון המולדת באוכלוסיות משקל יתר, ואתלטי במשך כמעט 20 שנה. 10,11 הטקסט להלן יספק את הקורא עם הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע assay זה ולהאיר אזורים שהקורא עשוי להתאים כדי לענות על הצרכים של המחקר שלהם.

Protocol

הערה: כל הנהלים איסוף דם נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מדינת האפלצ'ים (ASU) הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB). 1. הכנת Assay לאסוף, להכין, ולארגן את החומרים שצוינו עבור ההלי…

Representative Results

יש תרגיל ממושך ואינטנסיבי השפעה עמוקה על תפקוד מערכת חיסון מולד, כולל תפקוד תא רוצח טבעי, בתגובה בתיווך ציטוקינים מקרופאג זיהום ויראלי, ו גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB. מחקרים רבים מצביעים על כך מגביר phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים משמעותי ש…

Discussion

כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד עבור קביעת שני אינדיקטורים של גרנולוציט ותפקוד מונוציטים. זיהינו כמה צעדים חיוניים להצלחת assay זה. צעד אחד כזה הוא הדגירה-באמבט קרח המתרחשת באופן מיידי לפני תוספת של חיידקים. קירור יסודי של כל הדגימות יהיה למזער את השפעת הטמפרטורה על…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות זאק שו, קייסי ג'ון, ולין Cialdella-קם על סיועם במהלך אופטימיזציה של הליך זה.

Materials

12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10X), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample.
4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µL extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Play Video

Cite This Article
Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

View Video