Summary

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

Published: September 12, 2016
doi:

Summary

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Abstract

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

Introduction

Il granulociti e monociti fagocitosi / burst ossidativo (OB) saggio di attività è una tecnica semplice, straight-forward che viene spesso utilizzato per raccogliere informazioni sui innato funzione immunitaria dopo l'attività fisica intensa e prolungata. 1-4 Quando si studia la risposta del sistema immunitario a uno stimolo, granulociti e monociti sono di particolare interesse perché giocano un ruolo centrale nella difesa ospite e sono le prime cellule immunitarie per accumulare nel sito di infezione. 5 neutrofili, un tipo di granulociti, sono le prime cellule di traslocare nel muscolo danneggiato tessuto dopo l'attività fisica intensa. 6 fagocitosi e l'attività OB sono le misure più comuni di granulociti e monociti funzione, 7 e sono preferiti come indicatori di funzione delle cellule immunitarie innate a causa del loro ruolo centrale sia nel processo di infezione e il processo di riparazione.

Il test descritto in questo Utili manoscrittozes un flusso base citometro a fornire una determinazione quantitativa di granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB nel sangue intero. L'uso di sangue intero in questa tecnica è vantaggiosa perché permette il test da condurre senza una procedura di purificazione tempo. Questo test può essere facilmente modificato per accogliere una varietà di disegni di ricerca e capacità di laboratorio. Ad esempio, Liao et al. Utilizzato una tecnica simile a dimostrare che l'attività dei neutrofili OB è aumentata e neutrofili fagocitosi è diminuita in seguito a lesione cerebrale traumatica. 8 In un altro esempio, McFarlin et al. Descrive un elegante modifica di questa tecnica che utilizza allophycocyanin (APC ) coniugata CD66b e ad alte prestazioni in tandem APC-coniugato etichettatura CD45 con image-based citometria a flusso per classificare i granulociti in termini di attività di fagocitosi e OB. 7,9

Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato vari adattamenti di questo TEchnique come un indicatore della funzione immunitaria innata nelle popolazioni in sovrappeso, obesi, e atletiche per quasi 20 anni. 10,11 Il testo qui di seguito vi fornire al lettore con le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di questo test ed evidenziare le aree che il lettore può adattare per soddisfare le esigenze della loro ricerca.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Preparazione Assay Raccogliere, preparare e organizzare i materiali specificati per la procedura (si prega di fare riferimento alla tabella di specifici materiali / attrezzature). Etichettare tubi 12 x 75 mm. Etichetta due tubi per ogni partecipante: un tubo per il saggio fago…

Representative Results

attività intensa e prolungata ha effetti profondi sulla funzione immunitaria innata, tra cui la funzione Natural Killer delle cellule, la risposta dei macrofagi citochina-mediata alle infezioni virali, e granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB. Diversi studi indicano che i granulociti e monociti fagocitosi aumenta in modo significativo post-esercizio, che riflettono l'infiammazione indotta da danno muscolare e richieste metaboliche. Al contrario, granulociti e monocit…

Discussion

Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per la determinazione di due indicatori di granulociti e monociti funzione. Abbiamo identificato alcuni punti che sono fondamentali per il successo di questo test. Un tale passo è l'incubazione bagno di ghiaccio che si verifica immediatamente prima dell'aggiunta di batteri. raffreddamento completa di tutti i campioni minimizzerà l'effetto della temperatura sull'attività fagocitosi e OB. Un altro punto critico è l'aggiunta di batteri per ogni c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere Zack Shue, Casey John, e Lynn Cialdella-Kam per la loro assistenza durante l'ottimizzazione di questa procedura.

Materials

12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10X), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample.
4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µL extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
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  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
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  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
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Cite This Article
Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

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