La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana
Summary
The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.
Abstract
The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.
Introduction
El granulocitos y monocitos fagocitosis / explosión oxidativa (OB) ensayo de actividad es una técnica simple y directa que se utiliza con frecuencia para reunir información acerca de la función inmune innata después de un ejercicio prolongado e intensivo. 1-4 Al estudiar la respuesta del sistema inmune a un estímulo, los granulocitos y los monocitos son de particular interés, ya que juegan un papel central en la defensa del huésped y son las primeras células inmunes a acumularse en el sitio de infección. 5 neutrófilos, un tipo de granulocitos, son las primeras células de translocación de en el músculo dañado de tejidos después de un ejercicio intenso. 6 la fagocitosis y la actividad de OB son las medidas más comunes de granulocitos y monocitos función, 7 y se prefieren como indicadores de la función celular inmune innato debido a su papel central tanto en el proceso de infección y el proceso de reparación.
El ensayo descrito en este manuscrito utilizes un flujo básico citómetro para proporcionar una determinación cuantitativa de granulocitos y la fagocitosis de monocitos y la actividad OB en la sangre entera. El uso de sangre total en esta técnica es ventajosa porque permite que el ensayo se lleva a cabo sin un procedimiento de purificación que consume tiempo. Este ensayo se puede modificar fácilmente para acomodar una variedad de diseños de investigación y capacidades de laboratorio. Por ejemplo, Liao et al. Utilizó una técnica similar para mostrar que la actividad de neutrófilos OB se incrementa y neutrófilos fagocitosis se disminuye después de una lesión cerebral traumática. 8 En otro ejemplo, McFarlin et al. Describe un elegante modificación de esta técnica que utiliza aloficocianina (APC ) conjugado con CD66b y CD45 etiquetado APC-conjugado tándem de alto rendimiento con la imagen basada en citometría de flujo para clasificar los granulocitos en términos de sus actividades fagocitosis y OB 7,9.
Nuestro grupo de investigación ha utilizado diversas adaptaciones de la presente technique como un indicador de la función inmune innata en poblaciones con sobrepeso, obesos, y atléticas durante casi 20 años. 10,11 El texto a continuación proporcionará al lector con instrucciones paso a paso para realizar este ensayo y destacar las áreas que el lector pueda adaptarse para satisfacer las necesidades de sus investigaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para la determinación de dos indicadores de granulocitos y la función de monocitos. Hemos identificado algunos pasos que son críticos para el éxito de este ensayo. Una de estas medidas es la incubación baño de hielo que se produce inmediatamente antes de la adición de bacterias. enfriamiento a fondo de todas las muestras minimizará el efecto de la temperatura sobre la actividad de fagocitosis y OB. Otro paso crítico es la adición de las bacterias a cada mues…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer Zack Shue, Casey John y Lynn Cialdella-Kam por su ayuda durante la optimización de este procedimiento.
Materials
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10X), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µL extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
References
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