Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix
Summary
Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
Die Entwicklung von verzweigten epithelialen Geweben, als Verzweiger Morphogenese bekannt ist, wird von Zellen abgeleiteten, physikalischen und Umweltfaktoren reguliert wird. In der Brustdrüse, Morphogenese Verzweigung ist ein iterativer Prozess, durch den geführten kollektive Zellmigration eine baumartige Architektur schafft. Der erste Schritt ist die primäre Knospenbildung aus den Milchgängen, gefolgt von Zweig Initiierung und Dehnung 1,2. Invasion der Filialen in das umgebende Stroma wird durch die systemische Freisetzung von Steroidhormonen in der Pubertät induziert. Neue primäre Knospen initiieren dann von den Enden der bestehenden Filialen, und dieser Prozess wird fortgesetzt 3 eine epitheliale Baum zu erstellen. Obwohl viele wichtige biochemische Signale identifiziert wurden, ein umfassendes Verständnis der zellbiologischen Mechanismen, die diese komplexen Entwicklungsprozess führen derzeit fehlt. Darüber hinaus sind mechanistische Studien über die Einflüsse der spezifischen Signale nur schwer von Erfah zu dekonstruierenrungen in vivo sind so präzise Raum – Zeit – Störungen und Messungen oft nicht möglich.
Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken, wie beispielsweise Vollorgankultur, primäre Organoiden und Zellkulturmodellen, sind nützliche Werkzeuge für die systematische Untersuchung der Mechanismen , darunter liegende Gewebe – Morphogenese 4-6. Dies kann besonders nützlich sein für die Bestimmung der Einflüsse von spezifischen Faktoren einzeln, wie mechanische Kräfte und biochemische Signale auf einer Vielzahl von Zellverhalten, einschließlich der Migration, Proliferation und Differenzierung. 6 Engineered Zellkulturmodellen, insbesondere leicht die Störung ermöglichen von einzelnen Zellen und deren Mikroumgebung.
Eine solche Kulturmodell verwendet einen Mikro-basierten Ansatz Modell mammaepithelialen Gewebe zu konstruieren mit 3D-Struktur gesteuert, die konsistent und reproduzierbar Zweige bilden, die gemeinsam wandern, wenn sie mit dem eine induzierteppropriate Wachstumsfaktoren. Der große Vorteil des Modells ist die Fähigkeit, genau zu manipulieren und die Auswirkungen der physikalischen und biochemischen Faktoren, wie beispielsweise Muster der mechanischen Beanspruchung mit hoher statistischer Sicherheit messen. Diese Technik, die zusammen mit Computermodellierung, wurde bereits verwendet 7-11 die relativen Beiträge der physikalischen und biochemischen Signale in der Leitung von der normalen Entwicklung der Brust-Epithelgewebe und anderen verzweigten Epithelien zu bestimmen. Dargestellt ist hier ein detailliertes Protokoll für diese Modellgewebe Gebäude, das leicht auf andere Arten von Zellen und extrazellulären Matrix erweitert werden kann (ECM) Gele, und die dazu dient, als mögliches Instrument für die Prüfung von Therapeutika.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem NIH (HL118532, HL120142, CA187692), der David & Lucile Packard Foundation, der Camille & Henry Dreyfus-Stiftung unterstützt wird, und der Burroughs Welcome Fund. ASP wurde teilweise durch eine Charlotte Elizabeth Procter ehrende Fellowship unterstützt.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
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