הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס
Summary
כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
ההתפתחות של רקמות אפיתל מסועפות, המכונות הסתעפות morphogenesis, מוסדרת על ידי נגזר תאים, פיסיים, וגורמים סביבתיים. בלוטת החלב, הסתעפות morphogenesis הוא תהליך חוזר ונשנה שדרכו מודרך נדידת תאים קולקטיבית יוצרת אדריכלות עץ דמוי. השלב הראשון הוא היווצרות ניצן ראשית ממנהל צינוריות החלב, ואחריו ייזום סניף ואת התארכות 1,2. פלישה של סניפים לתוך stroma שמסביב היא מושרה על ידי השחרור המערכתי של הורמוני סטרואידים בגיל ההתבגרות. ניצנים ראשוניים חדשים ולאחר מכן ליזום מקצות סניפים קיימים, ותהליך זה ממשיך ליצור עץ אפיתל 3. למרות אותות ביוכימיים רבים חשוב זוהו, הבנה מקיפה של מנגנונים ביולוגיים תא המנחים תהליך התפתחותי מורכב זה כרגע חסר. יתר על כן, מחקרים מכניסטית על ההשפעות של רמזים ספציפיים שקשה לפרק מן ההתנסותמפעלי in vivo, פרעות spatiotemporal מדויקות כפי ומדידות הם בדרך כלל לא אפשריים.
תלת ממדי (3D) טכניקות תרבות, כגון תרבות איבר שלמה, organoids העיקרי, ומודלי תרבית תאים, הם כולים שימושיים באופן שיטתי חוקר את מנגנוני רקמת המורפוגנזה 4-6. אלה יכולים להיות שימושיים במיוחד לקביעת ההשפעות של גורמים ספציפיים בנפרד, כגון כוחות מכאניים אותות ביוכימיים, על מגוון רחב של התנהגויות תא, כולל הגירה, שגשוג, והבחנה. 6 דגמי תרבית תאים מהונדסים, בפרט, בקלות לאפשר ההפרעות של תאים בודדים microenvironment שלהם.
מודל תרבות אחת כזו משתמש בגישה מבוססת microfabrication להנדס רקמות אפיתל חלב מודל עם מבנה 3D מבוקר בעקביות reproducibly יוצרות סניפים נודדים קולקטיבי כאשר מושרה עם אגורמי גדילה ppropriate. היתרון העיקרי של המודל הוא היכולת לתפעל בדיוק ולמדוד את ההשפעות של גורמים פיסיים ביוכימיים, כגון דפוסי לחץ מכאני, עם ביטחון סטטיסטי גבוה. טכניקה זו, יחד עם מודלים חישוביים, כבר נעשה שימוש כדי לקבוע את התרומה היחסית של אותות פיזיים ביוכימיים הדרכתו של התפתחות תקינה של רקמות אפיתל החלב epithelia קנים אחרים 7-11. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לבניית רקמות מודל אלה, אשר יכול להתארך בקלות לסוגים אחרים של תאים תאי מטריקס (ECM) ג'לים, ואשר משמש ככלי פוטנציאל בדיקה של הרפוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (HL118532, HL120142, CA187692), דוד & לוסיל פקארד קרן, קמיל & הנרי דרייפוס קרן, ואת בורוז ברוך הבא הקרן. ASP נתמכה בחלקה על ידי מלגת כבוד שרלוט אליזבת פרוקטר.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
