Filtrering Isolering af nukleinsyrer: en enkel og hurtig DNA Extraction Method
Summary
Vi beskriver her en enkel og hurtig papirbaserede DNA ekstraktionsmetode af HIV proviralt DNA fra helblod påvist ved kvantitativ PCR. Denne protokol kan udvides til anvendelse i detektion andre genetiske markører eller anvendelse af alternative amplifikationsmetoder.
Abstract
FINA, filtrering isolering af nukleinsyrer, er en hidtil ukendt ekstraktionsmetode, som anvender vertikal filtrering via en adskillelse membran og absorberende pude til at udtrække cellulært DNA fra helblod på mindre end 2 min. Blodprøven behandles med detergent, blandet kort og anvendes med pipette til adskillelse membran. Lysatet væger ind i blotting pad skyldes kapillarvirkning, fanger det genomiske DNA på overfladen af adskillelsen membran. Det ekstraherede DNA tilbageholdes på membranen under en simpel vask trin, hvor PCR-inhibitorer er suget ind den absorberende blotting pad. Membranen indeholdende det indesluttede DNA tilsættes derefter til PCR-reaktionen uden yderligere oprensning. Denne simple metode kræver ikke laboratorieudstyr og kan let gennemføres med billige laboratorium forsyninger. Her beskriver vi en protokol til meget følsom påvisning og kvantificering af HIV-1 proviralt DNA fra 100 pi fuldblod som en model for tidligt iFant diagnose af HIV, der kunne let tilpasses til andre genetiske mål.
Introduction
Flere rapporter har drøftet udviklingen af papirbaserede eller membran-baserede ekstraktionsmetoder til brug i point-of-care (POC) enheder 1-5 med det formål at gøre den udsøgte sensitivitet og specificitet af molekylær diagnostik til rådighed for alle. World Health Organization (WHO) seksuelt overførte sygdomme Diagnose Initiative opfandt udtrykket ASSURED (Affordable, følsom, Specifikke, Brugervenlig, Rapid og robust, Udstyr-fri og leveret til dem, der har brug for det) til at beskrive de ideelle egenskaber for en POC test 6. Af disse retningslinjer, udstyret-fri kendetegn er særligt udfordrende at opnå for molekylær diagnostik. Enhver innovation på området, vil imidlertid fremme målet om at nå dem i de fleste behov, og der er håb for kortsigtede forbedringer test ydeevne ved at tilpasse eksisterende teknologi 7.
Her beskriver vi en enkel protokol til ekstraktion af DNA fra helblodsom ikke kræver komplekse kemi eller laboratorium instrumentering. Den FINA (filtrering isolation af nukleinsyrer) prøveforberedelse metode blev oprindeligt udviklet til at udtrække leukocyt DNA fra fuldblod for at opdage HIV-1 provirus som en del af en prøve-til-svar point-of-care (POC) kvantitativ PCR (qPCR) tidlig spædbarn diagnostisk (EID) platform til brug i begrænsede ressource indstillinger 8-11. FINA ekstraktion adskiller sig fra konventionelle oprensningsmetoder, som anvender silica membraner eller siliciumoxid-belagte paramagnetiske partikler til reversibelt binde DNA i nærvær af chaotrope midler 12. I stedet FINA anvender vertikal filtrering via en separationsmembran at ekstrahere cellulært DNA fra helblod direkte. Membranen indeholdende det indesluttede DNA kan placeres direkte i et PCR-rør og enten umiddelbart anvendt i en PCR-reaktion eller lufttørret til senere amplifikation 9. Ingen chaotropiske midler, phenol, eller alkoholer anvendes i prøven udvinding, elimineringTing de omfattende vask nødvendige skridt for at fjerne potente qPCR hæmmere afledt fra udvinding proces 13,14.
FINA membran kan fange enten celler 9 eller genomisk DNA frigivet ved cellelyse 11 før prøven tilsættes til membranen. For cellen capture fuldblod tilsat direkte til membranen. Cellerne efterfølgende lyseret i membranen ved tilsætning af 10 mM NaOH. Fordelen ved denne metode er, at det indebærer kun 3 trin: 1) prøvetilsætning; 2) cellelyse / vask og 3) filterskive placering i qPCR rør. Ulempen ved denne metode er, at membranen kun kan holde et defineret antal celler direkte proportional med diameteren af membranen disk. For at nå detektionsgrænsen kræves til EID, er 100 pi helblod nødvendig for prøve input, som medfører et filter, der er for stor til at blive placeret i en qPCR rør. Lysering af blodceller med vaskemiddel, før du tilføjer prøven til samlingenmembran tilføjer et behandlingstrin, men tillader anvendelsen af et mindre filter til den samme prøve størrelse. Vi var i stand til at demonstrere høj reproducerbarhed, afsløring enkelt kopi, og kvantificering af så lidt som 10 eksemplarer af HIV-1 proviralt DNA fra 100 ul blod ved hjælp af denne test konfiguration 11.
I denne rapport beskriver vi den FINA protokol som oprindeligt blev udviklet til laboratoriebrug. Membranen / filter sandwich kendt som den FINA prøveforberedelse modul kan tilberedes i store partier og oplagret til senere brug. Når enhederne skal ekstraheres denne proces tager 2 min og kan udføres i varierende størrelse batches. QPCR kan køres straks eller filtrene indeholdende den integrerede DNA kan opbevares, indtil det er bekvemt at udføre qPCR. Denne metode er meget bekvemt for rutinemæssig analyse af prøver i både lave og høje indstillinger ressource.
Protocol
Representative Results
Discussion
EID knyttet til hurtig adgang behandling har vist sig at reducere børnedødeligheden på grund af HIV-infektion 16. På grund af den fortsatte eksistens af maternelle antistoffer i et spædbarn blod, har hurtige hiv-antistof-test begrænset anvendelighed til bestemmelse af status af HIV-eksponerede børn. WHO anbefaler, at alle børn født af HIV-1-positive mødre bør testes ved 4-6 ugers alderen, ved hjælp af en virologisk test 17. Vi har rapporteret udvikling af et assay til påvisning og kvan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. “Paper Machine” for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. . Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. . Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- . . World Health Organization. , (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots–preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
