न्यूक्लिक एसिड की छानने का अलगाव: एक सरल और तेजी डीएनए निष्कर्षण विधि
Summary
हम यहाँ पूरे रक्त से एचआईवी proviral डीएनए के एक सरल और तेजी से कागज आधारित डीएनए निष्कर्षण विधि मात्रात्मक पीसीआर द्वारा पता लगाया वर्णन है। इस प्रोटोकॉल अन्य आनुवंशिक मार्करों का पता लगाने या वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर प्रवर्धन में उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
फिना, न्यूक्लिक एसिड की छानने का अलगाव, एक उपन्यास निष्कर्षण विधि है जो एक अलग झिल्ली और शोषक पैड के माध्यम से खड़ी छानने का इस्तेमाल कम से कम 2 मिनट में पूरे रक्त से सेलुलर डीएनए निकालने के लिए है। रक्त नमूना डिटर्जेंट, मिश्रित संक्षिप्त के साथ इलाज किया गया और जुदाई झिल्ली को pipet से लागू किया जाता है। lysate, केशिका क्रिया के कारण सोख्ता पैड में wicks जुदाई झिल्ली की सतह पर जीनोमिक डीएनए कब्जा। निकाले डीएनए एक सरल धोने कदम जिसमें पीसीआर अवरोधकों शोषक सोख्ता पैड में दुष्ट हैं दौरान झिल्ली पर बनाए रखा है। झिल्ली फँस डीएनए युक्त फिर आगे की शुद्धि के बिना पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। इस सरल विधि प्रयोगशाला के उपकरण की आवश्यकता नहीं है और आसानी से सस्ती प्रयोगशाला की आपूर्ति के साथ लागू किया जा सकता है। यहाँ हम जल्दी में के लिए एक मॉडल के रूप में 100 μl पूरे रक्त से अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने और एचआईवी -1 Proviral डीएनए के quantitation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनएचआईवी के fant निदान है कि आसानी से अन्य आनुवंशिक लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
कई रिपोर्टों उत्तम संवेदनशीलता और आणविक निदान की विशिष्टता सभी के लिए उपलब्ध बनाने के उद्देश्य से बिंदु का ख्याल (पीओसी) उपकरणों 1-5 में उपयोग के लिए कागज या झिल्ली आधारित निकासी तरीकों के विकास पर चर्चा की है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) यौन संचारित रोग निदान की पहल अवधि आश्वासन दिया (सस्ती, संवेदनशील, विशिष्ट, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, तेजी से और मजबूत, उपकरण मुक्त और जो लोग यह जरूरत के लिए दिया) का वर्णन करने के लिए आदर्श एक पीओसी की विशेषताओं गढ़ा परीक्षा 6। इन दिशा निर्देशों का, उपकरण मुक्त विशेषता विशेष रूप से आणविक निदान के लिए प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, इस क्षेत्र में हर नवाचार सबसे अधिक जरूरत है उन लोगों तक पहुँचने के लक्ष्य अग्रिम जाएगा, और वहाँ मौजूदा प्रौद्योगिकी 7 आदत डाल द्वारा परीक्षण के प्रदर्शन में निकट अवधि के सुधार के लिए आशा है।
यहाँ हम पूरे रक्त से डीएनए निकालने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णनकि जटिल रसायन शास्त्र या प्रयोगशाला इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। फिना (न्यूक्लिक एसिड की निस्पंदन अलगाव) नमूना तैयार विधि मूल के क्रम में एक नमूना जवाब बिंदु का ख्याल (पीओसी) के हिस्से के रूप में मात्रात्मक पीसीआर एचआईवी -1 provirus पता लगाने के लिए पूरे रक्त से ल्युकोसैट डीएनए निकालने के लिए विकसित किया गया था (qPCR) जल्दी शिशु नैदानिक (ईद) सीमित संसाधन सेटिंग 8-11 में उपयोग के लिए मंच। फिना निकासी जो सिलिका झिल्ली या सिलिका लेपित समचुंबक कणों का उपयोग reversibly chaotropic एजेंटों 12 की उपस्थिति में डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए पारंपरिक तरीकों शुद्धि से अलग है। इसके बजाय, फिना एक जुदाई झिल्ली के माध्यम से खड़ी छानने का काम करता सीधे पूरे रक्त से सेलुलर डीएनए निकालने के लिए। झिल्ली फँस डीएनए युक्त सीधे एक पीसीआर ट्यूब में रखा जा सकता है और या तो तुरंत एक पीसीआर प्रतिक्रिया या हवा बाद में प्रवर्धन 9 के लिए सूखे में इस्तेमाल किया। कोई chaotropic एजेंटों, फिनोल, या एल्कोहल नमूना निष्कर्षण में किया जाता है, eliminaटिंग व्यापक धोने कदम शक्तिशाली qPCR अवरोधकों निकालने की प्रक्रिया 13,14 से निकाली गई हटाने की जरूरत है।
फिना झिल्ली या तो कोशिकाओं 9 या जीनोमिक डीएनए नमूना झिल्ली में जोड़ा जाता है से पहले सेल 11 से आजाद कब्जा कर सकते हैं। सेल पर कब्जा के लिए, पूरे रक्त झिल्ली को सीधे जोड़ा जाता है। कोशिकाओं बाद में 10 मिमी NaOH जोड़कर झिल्ली में lysed रहे हैं। लाभ इस विधि के लिए है कि यह केवल 3 कदम शामिल है: 1) नमूना अलावा; 2) सेल / धोने और qPCR ट्यूब में 3) फिल्टर डिस्क स्थान। इस विधि को दोष यह है कि झिल्ली केवल सीधे झिल्ली डिस्क के व्यास के लिए आनुपातिक कोशिकाओं का एक निर्धारित संख्या में पकड़ कर सकते हैं। ईद के लिए आवश्यक पता लगाने की सीमा तक पहुँचने के लिए, पूरे रक्त के 100 μl नमूना इनपुट जो एक फिल्टर है कि बहुत बड़ी एक qPCR ट्यूब में रखा जा रहा है पर जोर देता लिए आवश्यक है। संग्रह करने के लिए नमूना जोड़ने से पहले साबुन से रक्त कोशिकाओं lysingझिल्ली एक प्रसंस्करण कदम कहते हैं, लेकिन एक ही नमूना आकार के लिए एक छोटे फिल्टर का उपयोग की अनुमति देता है। हम उच्च reproducibility, एक प्रति का पता लगाने, और इस परीक्षण विन्यास 11 का उपयोग रक्त के 100 μl से एचआईवी -1 Proviral डीएनए की प्रतियां के रूप में छोटा रूप में 10 की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने में सक्षम थे।
इस रिपोर्ट में, हम फिना प्रोटोकॉल मूल रूप से प्रयोगशाला उपयोग के लिए विकसित रूप का वर्णन है। झिल्ली / फिल्टर सैंडविच फिना नमूना तैयार मॉड्यूल के रूप में जाना जाता है बड़े समूहों में तैयार किया और बाद में उपयोग के लिए खरीदकर भंडार जा सकता है। निकाले जाने की जब नमूने हैं इस प्रक्रिया को 2 मिनट लगते हैं और आकार बैचों में अलग किया जा सकता है। qPCR तुरंत चलाया जा सकता है या जब तक यह qPCR प्रदर्शन करने के लिए सुविधाजनक है एम्बेडेड डीएनए युक्त फिल्टर संग्रहित किया जा सकता है। इस विधि दोनों कम और उच्च संसाधन सेटिंग में नमूनों की दिनचर्या विश्लेषण के लिए बहुत सुविधाजनक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
तेजी से इलाज के लिए उपयोग करने के लिए जोड़ा ईआईडी एचआईवी संक्रमण के कारण 16 शिशु मृत्यु दर को कम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। एक शिशु के रक्त में मातृ एंटीबॉडी के हठ की वजह से, तेजी से एचआईवी एंटीब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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