Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod
Summary
Vi beskriver här ett enkelt och snabbt pappersbaserade DNA-extraktionsmetod av HIV proviralt DNA från helblod detekteras genom kvantitativ PCR. Detta protokoll kan förlängas för användning vid detektion andra genetiska markörer eller använda alternativa amplifieringsmetoder.
Abstract
FINA, filtrering isolering av nukleinsyror, är en ny extraktionsmetod som utnyttjar vertikal filtrering via en separationsmembran och absorberande dyna för att extrahera cellulär DNA från helblod i mindre än två minuter. Blodet provet behandlas med detergent, blandas kortvarigt och appliceras med pipett till separationsmembranet. Lysatet vekar in i blotting dynan på grund av kapillärverkan, fånga den genom-DNA på ytan av separationsmembranet. Det extraherade DNA: t kvarhölls på membranet under en enkel tvättsteg, varvid PCR-inhibitorer är onda in i den absorberande blotting pad. Membranet innehållande det infångade DNA tillsätts sedan till PCR-reaktionen utan ytterligare rening. Denna enkla metod kräver inte laboratorieutrustning och kan lätt implementeras med billiga laboratorium leveranser. Här beskriver vi ett protokoll för mycket känslig detektion och kvantifiering av HIV-1 proviralt DNA från 100 | il helblod som en modell för tidigt ifant diagnos av HIV som lätt kan anpassas till andra genetiska mål.
Introduction
Flera rapporter har diskuterat utvecklingen av pappers- eller membranbaserade extraktionsmetoder för användning i point-of-care (POC) enheter 1-5 i syfte att göra den utsökta känslighet och specificitet av molekylär diagnostik tillgängliga för alla. Världshälsoorganisationen (WHO) med sexuellt överförbara sjukdomar Diagnostik Initiative myntade termen ASSURED (Prisvärd, känsliga, specifika, användarvänligt, Rapid och Robust, utrustning fritt och levereras till dem som behöver det) för att beskriva den idealiska egenskaperna hos en POC prov 6. Av dessa riktlinjer, är utrustningen fria egenskap särskilt svårt att uppnå för molekylär diagnostik. Dock kommer varje innovation inom området främja målet att nå dem som har störst behov, och det finns hopp för kortsiktiga förbättringar i test prestanda genom att anpassa befintlig teknik 7.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för extraktion av DNA från helblodsom inte kräver komplexa kemi eller laboratorieinstrument. FINA (filtrerings isolering av nukleinsyror) provberedning metod utvecklades ursprungligen för att extrahera leukocyt-DNA från helblod för att detektera HIV-1-provirus som en del av ett prov före svar point-of-care (POC) kvantitativ PCR (qPCR) tidigt spädbarn diagnostik (EID) plattform för användning i begränsade resursinställningar 8-11. FINA extraktion skiljer sig från konventionella reningsmetoder, vilka använder kiseldioxidpartiklar membran eller kiselbelagda paramagnetiska partiklar för att reversibelt binda DNA i närvaro av kaotropa medel 12. Istället använder FINA vertikal filtrering via ett separationsmembran för att extrahera cellulär DNA från helblod direkt. Membranet innehållande det infångade DNA kan placeras direkt i ett PCR-rör och antingen omedelbart användes i en PCR-reaktion eller lufttorkas för senare amplifiering 9. Inga kaotropa medel, fenol, eller alkoholer användes i provet extraktion, Eliminating omfattande tvättsteg som krävs för att avlägsna potenta qPCR inhibitorer härledda från utvinningsprocessen 13,14.
FINA membranet kan fånga antingen celler 9 eller genomiskt DNA som frigörs av cellys 11 innan provet tillsätts till membranet. För fångst cellen, är helblod tillsättas direkt till membranet. Cellerna därefter lyseras i membranet genom tillsats av 10 mM NaOH. Fördelen med denna metod är att den endast innebär tre steg: 1) tillsats av provet; 2) cellys / tvätt och 3) filterskiva placering i qPCR rör. Nackdelen med denna metod är att membranet endast kan hålla ett definierat antal celler direkt proportionell mot diametern på membranskiva. Att nå detektionsgränsen som krävs för elektronisk identifiering, är 100 | il helblod som krävs för provingång, som medför ett filter som är för stor för att placeras i en qPCR rör. Lysera blodcellerna med detergent före tillsats av provet till samlingenmembranen ökar ett bearbetningssteg, men tillåter användning av ett mindre filter för samma provstorlek. Vi kunde påvisa hög reproducerbarhet, enda kopia detektering och kvantifiering av så lite som 10 kopior av HIV-1 proviralt DNA från 100 | il av blodet med hjälp av denna testkonfiguration 11.
I denna rapport beskriver vi FINA protokoll som ursprungligen utvecklades för laboratoriebruk. Membranet / filter smörgås kallas FINA provberedning modul kan framställas i stora serier och lagring för senare användning. När exemplaren skall extraheras denna process tar 2 minuter och kan utföras i varierande stora serier. QPCR kan köras direkt eller filter innehållande den inbäddade DNA kan lagras tills det är lämpligt att utföra qPCR. Denna metod är mycket bekvämt för rutinanalys av prover i både låga och höga resursinställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
EID kopplad till snabb tillgång behandling har visat sig minska spädbarnsdödligheten på grund av HIV-infektion 16. På grund av den ihållande maternella antikroppar i ett spädbarns blod, har snabbtest HIV-antikropp begränsad användbarhet för att bestämma status av HIV-exponerade barn. WHO rekommenderar att alla barn födda till HIV-1-positiva mödrar bör testas vid 4-6 veckors ålder, med hjälp av en virologisk prov 17. Vi har rapporterat utvecklandet av en analys för detektering och k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. “Paper Machine” for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. . Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. . Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- . . World Health Organization. , (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots–preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
