L'isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce
Summary
Descriviamo qui un metodo di estrazione del DNA semplice e rapida cartaceo di HIV provirale DNA da sangue intero rilevato mediante PCR quantitativa. Questo protocollo può essere esteso per l'utilizzo nel rilevare altri marcatori genetici o utilizzando metodi di amplificazione alternativi.
Abstract
FINA, isolamento filtrazione di acidi nucleici, è un metodo di estrazione romanzo che utilizza filtrazione verticale tramite una membrana di separazione e tampone assorbente per estrarre DNA cellulare da sangue intero in meno di 2 min. Il campione di sangue viene trattata con un detergente, brevemente mescolato e applicato dalla pipetta alla membrana di separazione. Il lisato stoppini nel tampone assorbente per capillarità, catturando il DNA genomico sulla superficie della membrana di separazione. Il DNA estratto viene conservato sulla membrana nel corso di una semplice fase di lavaggio in cui gli inibitori della PCR sono malvagi nel tampone assorbente assorbente. La membrana contenente il DNA intrappolata viene quindi aggiunto alla reazione PCR senza ulteriore purificazione. Questo semplice metodo non richiede attrezzature di laboratorio e può essere facilmente implementato con materiale di laboratorio poco costoso. Qui si descrive un protocollo per il rilevamento ad alta sensibilità e la quantificazione del virus HIV-1 DNA provirale da 100 ml di sangue intero come modello per l'inizio inDiagnosi fant del virus HIV che potrebbe facilmente essere adattato per altri obiettivi genetici.
Introduction
Diversi rapporti hanno discusso lo sviluppo di metodi di estrazione carta- o membrana a base per l'uso in point-of-care (POC) dispositivi di 1-5, con l'obiettivo di rendere la sensibilità squisita e la specificità della diagnostica molecolare a disposizione di tutti. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) Malattie Sessualmente Trasmesse Diagnostica iniziativa ha coniato il termine ASSURED (a prezzi accessibili, sensibile, specifico, facile da usare, veloce e robusto, senza attrezzature e distribuito chi ne ha bisogno) per descrivere le caratteristiche ideali di un POC Test 6. Di queste linee guida, la caratteristica senza attrezzatura è particolarmente difficile da raggiungere per la diagnostica molecolare. Tuttavia, ogni innovazione nel campo avanzerà l'obiettivo di raggiungere le più bisognose, e non c'è speranza di miglioramento a breve termine in termini di prestazioni di prova adattando la tecnologia esistente 7.
Qui si descrive un protocollo semplice per l'estrazione del DNA da sangue interoche non richiede chimica complessa o strumentazione di laboratorio. La FINA (isolamento filtrazione di acidi nucleici) metodo di preparazione campione è stato originariamente sviluppato per estrarre il DNA dei leucociti dal sangue intero per rilevare l'HIV-1 provirus come parte di un point-of-care (POC) del campione alla risposta PCR quantitativa diagnostica piattaforma (EID) (qPCR) precoce infantile per l'utilizzo in contesti di risorse limitate 8-11. Estrazione FINA differisce dai metodi di purificazione convenzionali che utilizzano membrane di silice o silice particelle paramagnetiche rivestite di legarsi reversibilmente DNA in presenza di agenti caotropici 12. Invece, FINA utilizza filtrazione verticale attraverso una membrana di separazione per estrarre DNA cellulare da sangue intero direttamente. La membrana contenente il DNA intrappolata può essere collocato direttamente in un tubo di PCR e sia immediatamente utilizzato in una reazione PCR o aria secca per la successiva amplificazione 9. Senza caotropici agenti, fenolo, o alcoli sono utilizzati per l'estrazione del campione, eliminaTing le ampie fasi di lavaggio necessari per rimuovere potenti inibitori qPCR derivanti dal processo di estrazione 13,14.
La membrana FINA può catturare sia cellule 9 o DNA genomico liberati da lisi cellulare 11 prima che il campione viene aggiunto alla membrana. Per la cattura delle cellule, sangue intero viene aggiunto direttamente alla membrana. Le cellule sono poi lisate nella membrana per aggiunta di 10 mM NaOH. Il vantaggio di questo metodo è che si tratta solo 3 fasi: 1) l'aggiunta del campione; 2) la lisi cellulare / lavaggio e 3) il posizionamento del disco filtro in tubo qPCR. Lo svantaggio di questo metodo è che la membrana può contenere solo un numero definito di cellule direttamente proporzionale al diametro del disco membrana. Per raggiungere il limite di rilevazione necessario per EID, 100 ml di sangue intero è richiesto per l'ingresso di campionamento che comporta un filtro che è troppo grande per essere inserito in un tubo qPCR. Lisi delle cellule del sangue con detersivo prima di aggiungere il campione alla raccoltamembrana aggiunge una fase di elaborazione, ma consente l'uso di un filtro più piccolo per la stessa dimensione del campione. Siamo stati in grado di dimostrare alta riproducibilità, la rilevazione solo esemplare, e la quantificazione di un minimo di 10 copie di HIV-1 DNA provirale da 100 ml di sangue che utilizzano questa configurazione di prova 11.
In questo rapporto, descriviamo il protocollo FINA come originariamente sviluppato per l'uso in laboratorio. Il sandwich membrana / filtro noto come modulo di preparazione del campione FINA può essere preparato in grandi lotti e stoccato per un uso successivo. Quando i campioni vengono estratti questo processo richiede 2 min e può essere eseguita in diversi lotti di dimensioni. La qPCR può essere eseguito immediatamente o dei filtri contenenti il DNA incorporato può essere conservato fino a quando non è conveniente per eseguire qPCR. Questo metodo è molto comodo per le analisi di routine, di esemplari in entrambe le impostazioni alte e basse risorse.
Protocol
Representative Results
Discussion
EID legata al trattamento di accesso rapido ha dimostrato di ridurre la mortalità infantile a causa di infezione da HIV 16. A causa della persistenza di anticorpi materni nel sangue di un neonato, rapidi test degli anticorpi HIV hanno limitato l'utilità per determinare il carattere dei bambini HIV-esposti. L'OMS raccomanda che tutti i bambini nati da madri HIV-1 positivi dovrebbero essere testati a 4-6 settimane di età, utilizzando un test virologico 17. Abbiamo riportato lo sviluppo di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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